Till startsida

Forskningsrapporter

år 2009
år 2008
år 2007 
år 2006 
år 2005
år 2004
år 2003
 

Register avseende forskningsrapporter för år 2009

Urban Wiklund;                                   Hjärtfrekvensvariabilitet och blodtryckstegring hos FAP-patienter
Intissar Anan;                                       Autofagi i FAP Patogenesen  
Anders Olofsson;                                 Transthyretin - struktur och giftighet
Elisabet Sauer-Eriksson;                      Fragmentbaserad läkemedelssökning av transthyretin
Ole Suhr;                                                 Mitokondiens betydelse
Erik Nordh och Victoria Heldestad;    Screening med sensorisk testning
Per Westermark och Elisabet Ihse;     Fortsatta undersökningar av familjär amyloidos av tranthyretinnatur
Erik Lundgren;                                       Transtyreetingenen i bananfluga
 

Forskningsrapport 2009
Erik Lundgren

Redovisning för projektet Transthyretingenen i bananfluga – en modell för FAP (Familjär amyloidos med polyneuropati)?

Mellan bananfluga (Drosophila melanogaster) och människa finns uppenbara skillnader. En viktig är ett annorlunda immunsystem. Men det finns likheter, som forskare länge använt sig av. Hur proteiner veckas och hur celler tar hand om felaktiga proteiner är generella frågor, som är gemensamma för alla biologiska system. Hit hör också cellskada och celldöd. Vi kan därför ställa mycket grundläggande frågor om amyloidsjukdomen. I bananfluga kan vi manipulera med gener, som är omöjligt i högre organismer bland annat av etiska skäl.

Vi frågar oss hur transthyretin (TTR) bildar toxiska aggregat och amyloidfibriller och hur dessa skadar perifera nerver. Kan den kunskapen hjälpa oss att söka efter läkemedelskandidater som hämmar bildning TTR-aggregat, löser upp dem eller hämmar deras toxiska effekter?

Vi har tidigare visat att det går att föra in muterade gener av transtyretin (TTR) i bananflugor, och att dessa får svårighet att gå och flyga, samt att livslängden förkortas. Sådana effekter är lätta att avläsa och liknar de symptom som FAP-sjuka individer har. Det kan användas för att både förstå sjukdomsmekanismer och för att leta efter läkemedel.

Innan nya substanser prövas på människa krävs i regel djurförsök. Det är oetiskt att testa nya substanser med okända verkningar och biverkningar på sjuka. Man måste visa för läkemedelsmyndigheterna hur en ny substans fungerar. När det gäller FAP är genen aktiv hela livet. Det kan betyda långvarig behandling, vilket ställer krav på få biverkningar, vilket kan studeras i djurmodeller. Det vanligaste försöksdjuret, genetiskt modiferade möss har fungerat dåligt vid FAP.
 

Vi har förfinat modellen och visat att de aggregat man har i fettkroppen (flugans lever), verkligen är TTR och bildar amyloid. Två slags aggregat ses, dels toxiska små aggregat, dels stora amyloidlika som inte är toxiska. Båda kan vara viktiga för att pröva läkemedelskandidater

Vi har inlett samarbete med prof. Jin-Ping Li, Uppsala, som arbetar med stora svavelrika sockerarter, som finns kring all amyloid. Hon har visat i provrörsförsök att heparin, som är en sådan molekyl, ökar amyloidbildning. Vi kan bekräfta att det också sker i flugorna och vill i fortsättningen se om heparin minskar förekomsten av små toxiska aggregat.

I samarbete med professor Fredrik Almqvist, Kemiska institutionen i Umeå, har vi undersökt ett stort antal substanser som hämmar amyloidbildning i provrör. Principen fungerar med diflunisal och diclofenax, som både stabiliserar TTR. Tyvärr krävs höga koncentrationer, som är skadliga för flugorna. Vi har tills vidare lagt detta åt sidan, i väntan på provrörsförsök som syftar till att identifiera bättre fungerande substanser, som kräver lägre dos.

Däremot arbetar vi med Dr Anders Öhman, som tillsammans med prof. Elisabeth Sauer-Eriksson och forskningsassistent Anders Olofsson utvecklar ett system där små molekyler, som binder till TTR kopplas ihop till större enheter, med stor stabiliserande förmåga. Det skulle leda till att vi får så hög stabilisering av TTR and den inte faller sönder till de byggstenar som tjänar som förstadium till toxiska aggregat.

Målsättningen är fortfarande att få fram åtminstone en substans, som har så god effekt att den är intressant för kliniska försök på människa enligt det regelsystem som gäller.

Forskningsrapport 2009
Per Westermark och Elisabet Ihse

Fortsatta undersökningar av familjär amyloidos av transthyretinnatur

Vi har, som vi tidigare meddelat, kunnat konstatera att fragmenterat TTR förekommer dels hos många, men inte alla, individer med den vanliga svenska mutationen och dels vid senil systemamyloidos. Hjärtinlagringar med fragmenterat TTR tenderar att vara större och ha annan fördelning är inlagringar med helt TTR. Typiskt för senil systemamyloidos är rikliga och ibland allvarliga hjärtinlagringar. Vi misstänker att fragmentering på ännu okänt sätt avspeglar en viktig process vid amyloidbildning från TTR. Det är också möjligt, men ännu definitivt inte bevisat, att fragmentering av TTR kan vara en riskfaktor för hjärtinlagringar. Vi har under året analyserat och sammanställt de resultat vi fått fram, bl.a. genom den provtagning som vi genomförde i Piteå 6 dec 2008. Vi har nu klart kunnat visa att amyloid i bukfettvävnad både hos individer med helt och med fragmenterat TTR till genomsnittligt ungefär 40% består av icke-muterat protein. Efter levertransplantation, däremot, hade proportionen inte muterat protein stigit till 95% hos personer med fragmenterat TTR men endast till 81% hos sådana med helt TTR. Dessa resultat visar två viktiga saker:

1. amyloid innehållande fragmenterat TTR verkar dra åt sig mer ”normalt” protein (vilket stöder vår hypotes) och

2. omsättningen av molekyler i amyloid verkar vara mycket större än vi trott. Detta senare faktum tror vi är ett mycket hoppfullt tecken: det innebär rimligen att om man kan komma på en metod att lösa upp amyloid kan den försvinna tämligen snabbt.
 

För att få mer bevis för våra teorier vill vi studera också andra mutationer och därför har vi inlett ett samarbete med ett par italienska forskargrupper ledda av professorerna Rapezzi och Merlini i Bologna respektive Pavia. Vi har från dessa fått små hjärtbiopsier där vi studerat förekomst av fragmentering. I alla de prover, som vi hittills undersökt har vi funnit kluvet TTR. Vad vi saknar så här långt är material från personer utan hjärtinlagringar.
 

EU-projektet ”Systemic amyloidosis in Europe, EURAMY” går nu mot sitt slut. Vi fick en önskad förlängning om ett halvt år, vilket är maximalt vad EU ger. Det finns inga möjligheter till ytterligare förlängningar. Då det samarbete, som kommit igång inom Europa genom EURAMY varit och är mycket värdefullt, försöker vi hitta nya utvägar till finansiering, fortfarande genom EU. Vi kommer att rapportera om resultaten.
 

Det arbete som föreningarna FAMY och FAMY Norrbotten samt stiftelsen Amyl utför är mycket värdefullt för vår forskning. Att träffa patienter och anhöriga är för oss en stark drivkraft för fortsatt forskningsarbete.

Forskarrapport 2009
Erik Nordh och Victoria Heldestad

Screening med kvantitativ sensorisk testning för tidig upptäckt av symptomgivande amyloidossjukdom 

Vid Klinisk neurofysiologi på Norrlands universitetssjukhus i Umeå pågår ett projekt för att utveckla metoder som på ett tidigt stadium kan spåra tecken på att anlagsbärare med Val30Met-mutation börjar utveckla nervpåverkan som tecken på klinisk amyloidossjukdom. Inom projektet, som stöds genom forskningsanslag från Stiftelsen AMYL och FAMY-Norrbotten, har under 2009 studerats tillförlitligheten av de testmetoder som kliniskt används för att bedöma funktionen i de tunna nervtrådarna, som först påverkas vid amyloidosneuropati. 

I Sverige drabbas varje år omkring ett tjugotal personer av TTR-amyloidossjukdom. Andelen insjuknade är i Västerbotten och Norrbotten 30-40 per miljon invånare. Alla bärare av sjukdomsgenen kommer dock inte att utveckla tecken på nervskada, utan bara 10-15% får symptom på t.ex den polyneuropati som gett sjukdomen dess tidigare namn ’FAP’ – familjär amyloidos med polyneuropati.

Klinisk neurofysiologi har som uppgift att bistå sjukvården med utredningar av skador och störningar i nervsystemet, med hjälp av mätningar av de elektriska egenskaperna i kroppens nervtrådar. Dessvärre går det dock inte att mäta de elektriska egenskaperna i de tunna nervtrådar som först skadas vid amyloidos. För att utvärdera funktionen i dessa nervtrådar kan man i stället använda s.k. kvantitativa psykofysiska metoder (QST), som mycket noggrant mäter hur kraftiga retningar som behövs för att en person ska uppfatta en känselstimulering. En för de flesta välkänd sådan testning från vardagslivet är hörseltestningen, där hörselsinnet testas med hjälp olika starka ljudsignaler. För att bedöma tillståndet i kroppens tunna nervtrådar mäts med QST förmågan att känna varma och kalla temperaturer med en liknande teknik.

I samarbete med FAP-teamen vid NUS samt i Skellefteå och Piteå har vi under flera år med hjälp av temperaturtestning undersökt patienter som insjuknat i amyloidos. Detta projekt har visat att metoden tidigt kan påvisa en nervskada under utveckling hos dessa patienter. QST-testning av temperatursinnet har därigenom blivit ett viktigt komplement för att på ett tidigt stadium kunna spåra när patienter med en Val30Met-mutation börjar utveckla en symptomgivande sjukdomsbild.

En viktig aspekt för att värdera tillförlitligheten i QST är att kontrollera hur konstanta de uppmätta värdena är vid upprepad testning. Under det gångna året har därför metoden för QST-testning av temperatursinnet utvärderats noggrant, för att kontrollera reproducerbarheten i bestämningarna av temperaturtrösklar. Resultaten visar att metoden har en hög reproducerbarhet mellan testningarna, såväl från dag till dag som mellan mätningar gjorda med en veckas mellanrum. Samtidigt har framkommit att tillförlitligheten i tröskelbestämningen kan påverkas av i vilken ordning olika typer av temperaturtrösklar testas. Om exempelvis köldtrösklar bestäms som första test är tillförlitligheten större än om köldtrösklar mäts efter bestämning av trösklar för värmesmärta. Resultaten visar därigenom att rätt undersökningsmetodik är väsentlig, och att därför procedurerna för testning kräver en hög grad av standardisering. Resultaten från undersökningarna kommer att bidra till att höja kvalitén på den neurofysiologiska diagnostiken i de kliniska patientundersökningarna, såväl i Sverige som internationellt.

Samtidigt har även påbörjats utvärdering av möjliga samband mellan temperaturtrösklar och andra fysiologiska mått som används för att belysa tillståndet i tunna nervtrådar, t ex variabiliteten i hjärtrytmen eller kroppens förmåga att reglera blodtrycket vid uppresning av kroppen. Dessa analyser visar att det bland FAP-patienter inte går att visa enkla samband mellan de olika måtten, men även att skillnader finns mellan patienter med tidig och sen debut av sjukdomen. Detta antyder att olika nervtrådstyper kan påverkas på olika sätt av amyloidossjukdomen. Fynden tyder därigenom på att en enstaka mätmetod inte kan användas för att påvisa en begynnande störning i de tunna nervtrådarnas funktion, utan att flera kompletterande tester behövs för att kunna göra en heltäckande undersökning av en patient.

De resultat som hittills framkommit i projektet har redan inneburit att de kliniska neurofysiologiska utredningsrutinerna för patienter med möjlig amyloidossjukdom har kunnat förbättras. Genom att standardisera och förenkla de grundläggande testerna av nervfunktionen har väntetiderna förkortats för patienter med misstänkt nervpåverkan. Dessutom har ett mer systematiskt utnyttjande av QST-testning medgett att misstänkta FAP-patienter i primärvården snabbare kunnat remitteras för kompletterande utredningar vid specialistteamen.

Forskningsrapport 2009
Ole Suhr

 Mitokondriens betydelse för ålder vid insjukande samt amyloidfibrilltypens betydelse för överlevnaden vid sen sjukdomsdebut

Under året har vi publicerat 4 artiklar samt deltagit i 2 läkemedelsprövningar av bromsmediciner, där resultatet för en studie föreligger men inte publicerats än.

Mitokondrien är cellernas ”energicentral”. Det är där man utnyttjar syre för att utvinna energi av t.ex. socker. Mitokondrien är också speciell eftersom den har sitt eget arvsanlag och styrs alltså inte från cellkärnan. Speciellt för mitokondrien är också att vi ärver arvsanlaget enbart från vår mor. Vi har undersökt om typ av arvsanlag för mitokondrien kan ha betydelse för ålder vid insjuknande. Patienter med tidig sjukdomsdebut har oftare en annan typ av mitokondriegener än dom som insjuknar sent (över 50 års ålder). Mitokondrien har också betydelse för bildningen av giftiga produkter i samband med förbränning av näringsmedel, och kan påverka veckningen av äggviteämnen och kan därför ha betydelse för amyloidbildning.

En av artiklarna handlar om en modifierad metod för bestämning av halten av muterat transthyretin i vävnader och blod. Metoden har tidigare använts när prof. Yukio Ando arbetade med oss i Umeå och är en fortsättning på hans arbete med att utveckla och förfina metoden.

Vi har fortlöpande uppföljning på levertransplanterade patienter, och har publicerat en rapport om överlevnad efter levertransplantation. Vi har undersökt betydelse av ålder och kön för överlevnad efter transplantation. Som vi misstänkte är överlevnaden sämre för patienter med sen debut av sjukdomen. Hos denna grupp av patienter har vi inte kunnat påvisa någon ökad överlevnad, dock verkar det som om kvinnor med sen debut har en bättre överlevnad än män. Vi håller på att undersöka om amyloidfibrilltyp har betydelse för detta fynd, då vi vet att äldre patienter oftare har en blandform av fullängd och förkortade transthyretin fibriller, jämfört med yngre patienter.

I samarbete med läkare över hela Sverige har vi lyckats att diagnostisera flera nya mutationer, bl.a. en ytterst sällsynt mutation som har symptom från det centrala nervsystemet. Flera av patienterna med dessa nya mutationer har transplanterats, men tyvärr utan effekt på sjukdomsförloppet för några av dessa patienter.

Vi kommer att fortsätta vår uppföljning av våra transplanterade patienter, dessutom eventuellt påbörja nya läkemedelsbehandlingar, härunder genterapi som kommer att försöka tysta transthyretingenen. Vi vill också fortsätta våra genetiska studier, där vi har hittat en unik förändring i den del av transthyretingenen som reglerar produktionen av transthyretin. Detta kan förklara varför svenska patienter har en senare debut av sjukdomen.

Forskningsrapport
Elisabet Sauer-Eriksson m.fl.

Fragmentbaserad läkemedelssökning av transthyretin

Vårt samarbetsprojekt vid Umeå universitet går ut på att med hjälp av fragmentbaserad läkemedelssökning eller sk "fragment lead-design" identifiera nya molekyler som binder och förhindrar amyloid-bildning av transthyretin. Molekylfragmentens förmåga att förhindra amyloid-bildning studeras i biologiska assays, och fragmentens exakta bindning till transthyretin karakteriseras strukturellt. När vi vet exakt hur varje fragment binder till proteinet kan vi genom organisk syntes kombinera ihop flera mindre fragment till allt större molekyler med en större potential att kunna fungera som läkemedel. Det övergripande målet är att hitta kombinationer av dessa små fragment som tillsammans kan fungera som potentiella läkemedelskandidater för FAP.

Arbetet utförs tillsammans med Anders Öhman och Fredrik Almqvist (institutionen för kemi) samt Anders Olofsson (institutionen för medicinsk biokemi och biofysik). Hittills har 85 nya bindare till transthyretin identifierats, och vi arbetar nu på att strukturellt karakterisera hur dessa binder till proteinet.

Forskningsrapport 2009
Anders Olofsson

Transthyretin – struktur och giftighet

Familjär amyloidos med polyneuropati (FAP) orsakas genom punktmutationer i plasmaproteinet transthyretin där idag är över 80 olika varianter är kända. Genom dessa förlorar proteinet delar av sin stabilitet vilket i sin tur leder till aggregering och slutligen resulterar i amyloida depositioner som återfinns i olika vävnader. De molekylära mekanismerna bakom proteinets egenskaper samt på vilket sätt aggregaten får en vävnadsskadande effekt är inte utrönt. Vi har fokuserat på flera delar i denna process där vi försöker förstå detaljerna bakom proteinets aggregerade egenskaper samt genom olika cellsystem försöker fastställa vilka specifika former som ger en cytotoxisk effekt.
 

Mekanismerna med vilka transthyretin samt även amyloid generellt ger en cytotoxisk effekt har studerats i detalj. Flera undersökningar pekar idag dock mot att de mest potenta aggregaten inte utgörs av den mogna amyloiden utan istället av förstadier bestående av lågmolekylära sammansättningar. Vi har utvecklat ett mycket robust cell-baserat system som bygger på odling av en human nervcellslinje. Genom detta system kan vi korrelera effekten av olika strukturella förändringar på protein med dess cytotoxiska effekt och alltså mäta graden av ”giftighet”. På detta sätt kan vi snabbt få en återkoppling mellan biokemiska resultat och dess fysiologiska effekt. Detta är absolut nödvändigt vid studier av det generella fenomen som gör att transthyretin övergår till en giftig form men även vid studier av nya inhibitorer.
 

Vi kan genom detta system idag påvisa att TTR kan inducera en skadlig effekt utan att först aggregera och där dess normala proteinstruktur verkar ligga mycket nära den giftiga arkitekturen.
 

Vi kan genom ett nyligen gjort fynd även separera dessa två olika former och avser att inom kort studera dessa med högupplöst kärnmagnetisk resonans spektroskopi (NMR) för att i detalj identifiera den strukturella skillnaden. Genom denna kunskap ökar dels den generella förståelsen för sjukdomar associerade till förändringar i proteinet transthyretin men även möjligheterna att specifikt förhindra denna förändring genom design av specifika inhibitorer.  

Forskningsrapport 2009
Intissar Anan

Autofagi i FAP Patogenesen  

Under året 2009 har vi jobbat med projektet ”Heat shock proteiner och high mobility group protien-1 och dess roll i patogenesen (sjukdomsframkallandet) av FAP”, där vi har hunnit analysera och statistiskt bearbeta många delar av detta projekt men dock återstår en del att analysera. Gällande projektet ”autofagi” är vi i startgroparna för detta och det återstår en del planering innan analys kan startas. Nedan följer en sammanfattning av resultaten.
 

Heat shock proteiner (stabila äggviteämnen som kommer till uttryck under ökad värme och stress) och chaperone proteiner (hjälper proteiner, hjälper till att felveckade proteiner får rätt form eller att de kan tas om hand):

Det analyserades intracellulära (inne i cellen) chaperone proteiner, Hsp 60 och 70, i vävnads- material hos FAP patienter och kontroller (kontrollpersoner). De extracellulära (utanför cellen) chaperone proteiner Cluterin, Haptoglobin och alfa2-makroglobulin analyserades alla i blodprover och för clusterin även analys i vävnadsmaterial från magsäcken. Resultaten visar:

Ø  Intracellulära chaperone proteiner, Hsp 60 and 70, visade ingen signifikant skillnad mellan FAP patienter och kontroller i vävnadsmaterialet. Detta betyder då att dessa proteiner inte är inblandade i FAP-sjukdomsframkallandet.

Ø  Extracellulära chaperone proteiner, Clusterin visade högre koncentrationer i serum (blod) hos FAP patienter jämfört med kontroller (p= 0.034).

Ø  Haptoglobin visade statistiskt signifikant högre koncentrationer i serum hos FAP patienter jämfört med kontroller (p= 0.037).

Ø  Ökning av Clusterin och Haptoglobin hos FAP patienter tyder på en uppreglering av dessa proteiner som svar på en ökad amyloidaggregering.

Ø  Alpha2-makroglobulin visade statistiskt signifikant lägre koncentrationer i serum hos FAP patienter jämfört med kontroller (p= 0.012).

Dessa resultat är mycket intressanta och det återstår en del att analysera vad gäller Haptoglobin och Alfa2-makroglobin i vävnadsmaterialet och även att studera interaktionen mellan komplex av chaperone protein-amyloid och receptorer. Detta för att kunna säkerställa en relation mellan dessa proteiner och amyloidinlagring. Skulle ett sådant samband kunna bevisas kommer det att öppnas en alternativ terapi för FAP.

Forskningsrapport 2009
Urban Wiklund

Hjärtfrekvensvariabilitet och blodtrycksreglering hos patienter med familjär amyloidos med polyneuropati 

Bakgrund: Patienter med  sjukdomen familjär amyloidos med polyneuropati (FAP) har ofta mycket oregelbunden hjärtfrekvens på grund av förmaksarytmier och överledningsrubbningar, vilket försvårar bedömningen av hur nervsystemet styr hjärtats funktion. I flera tidigare studier  har vi funnit att många FAP-patienter har förhöjd hjärtfrekvensvariablitet på grund av svårupptäckta förmaksarytmier, med vilket vi avser arytmier som ofta inte upptäcks vid sedvanliga arytmianalyser av Holter-EKG samt andra EKG-registreringar. Hos några patienter med mycket hög hjärtfrekvensvariabilitet kan det därför vara svårt att avgöra om en stor variation i hjärtfrekvens är ett normalt fynd eller om det beror på en onormalt utlöst förmaksrytm.

Projektbeskrivning: Syftet med detta projekt var att fortsätta med utvecklingen av nya matematiska analysmetoder för att upptäcka om FAP-patienter har störningar i det autonoma nervsystemet, d.v.s. den icke-viljestyrda del av nervsystemet som styr kroppens olika organ hos patienter med FAP. För närvarande pågår ganska många olika delprojekt där vi studerar samvariationen i hjärtfrekvens, blodtryck och andningsmönster. Vi har bl.a. arbetat med följande studier under 2009-2010.

1. I samarbete med Konen Obayashi har vi genomfört en studie av hur blodtrycket förändras hos FAP-patienter efter en tippningstest. Vi denna test tippas patienten till upprätt position och därefter tillbaka till liggande position (s.k. ”tilt reversal”). Hos andra patientgrupper med autonoma funktionsrubbningar har man observerat en blodtrycksstegring efter en sådan tippningstest. Syftet var att undersöka om detta fenomen även finns hos patienter med FAP. Studien påbörjades medan Konen Obayashi gjorde sin post-doc i Umeå och data samlades in från 14 patienter och 15 friska kontrollpersoner.  Resultaten visade att blodtrycksstegringen efter tippningstest var signifikant högre hos FAP patienterna än hos kontrollerna, samt att nivån på blodtryckssteringen ökade med minskande hjärtfrekvensvariabilitet.  Sammanfattningsvis visade studien att förekomsten av en blodtrycksstegring efter en tippningstest kan vara ett viktigt komplement vid bedömning av funktionen i det autonoma nervsystemet.  Ett manus har skickats in till en vetenskaplig tidskrift i mars 2010.

2. Vi har påbörjat en studie av samvariationen  mellan hjärtfrekvensvariabilitet och andningsmönster vid djupandningstest. Hos friska individer är hjärtfrekvensen synkroniserad med andningen vid  styrd djupandning med 6 andetag/min. Vi har dock tidigare visuellt noterat att många FAP-patienter uppvisar en mycket oregelbunden variation i hjärtfrekvens vid djupandningstesten. I detta delprojekt har vi utvecklat en metod baserad på s.k. Fourierseriananlys för att få fram ett objektivt mått på regelbundenheten i andningsmönster och hjärtfrekvens vid djupandningstestet. En första analys har utförts baserat på 61 FAP-patienter och 88 friska försökspersoner. Av dessa uteslöts 10 patienter och 18 kontroller p.g.a. oregelbundna andningssignaler, vilket sannolikt berodde på dålig teknisk kvalitet.  Analyserna visade att 11/51 (22%) patienter uppvisade relativt normala värden på hjärtfrekvensvariabiliteten med hade avsevärt lägre mått på ett index på regelbundenhet än de friska försökspersonerna. Dessa fynd visar att det är mycket viktigt att kritiskt granska alla FAP-patienter som uppvisar höga värden på hjärtfrekvensvariabilitet vid en djupandningstest. Notera att djupandningstest utförs för att utvärdera autonom funktion i pågående läkemedelsstudier. Ett bidrag till en vetenskaplig konferens har skickats in baserat på dessa fynd och vi avser att sammanställa en vetenskaplig artikel under 2010.

Register avseende forskningsrapporter för år 2008

Urban Wiklund  -  Hög hjärtfrekvensvariabilitet - autonom styrning eller svårupptäckt förmaksarytmi
Per Vestermark - Studier av skillnaden mellan de två formerna av familjär transthyretinamyloid
Anders Olofsson - En giftig variant av TTR kan hållas i ett icke aggregerat stadium
Ole Suhr - Genetiska markörer för FAP inkl. undersökning av mitokondrie DNA
Erik Lundgren - metod för utveckling av hämmande läkemedel
 

Forskningsrapport 2008

Erik Lundgren

Redovisning för projektet Amyloidbildning av transthyretin - metod för utveckling
av hämmande läkemedel.

Arbetet med bananfluga (Drosophila melanogaster) har fortsatt. Vi frågar oss hur transthyretin (TTR) bildar toxiska aggregat och amyloidfibirller och hur dessa åstadkommer skada på perifera

nerver. Vidare undersöker vi om bananfluga kan användas för att söka efter läkemedelskandidater

som hämmar bildning av aggretat av TTR, löser upp dem eller hämmar deras toxiska effekter.

Vi har tidigare visat att det går att föra in muterade gener av transtyretin (TTR) i bananflugor, och att dessa får svårighet att gå och flyga, samt att livslängden förkortas. Detta är symptom, som vi menar är användbara för att mäta effekten av läkemedelskandidater som vi vill pröva ut och liknar de symptom som patienter med familjär amyloidos med polyneuropati (’Skellefteåsjukan’) har.

Det är angeläget att hitta djurmodeller för nya läkemedel. Det är inte etiskt försvarbart att testa nya substanser med okända verkningar och biverkningar på sjuka människor. Därför är det föreskrivet i svensk lag och i bindande EU-direktiv att så skall ske. Det är även önskvärt att man vet vid vilken dos man får biverkningar. Det prövas i regel med att höja dosen på försöksdjur till dess man når den nivå som leder till att djuren dör. Helst vill man att den dosen skall ligga långt utöver den dos som ger behandlingseffekt hos människa, kanske 1000 gånger högre eller mer. Djur är också användbara för att studera verkningsmekanismer.

Problemet vid Skellefteåsjukan är att det inte gått att göra sådana sjukdomsmodeller i möss, som är det vanligaste djurslaget vid genetisk sjukdom. De får inte amyloid längs nerverna, och de har få eller inga symptom.

Då kan bananfluga vara ett alternativ hos insekter finns inte heller de etiska problem som vi förknippar med högre djurslag. Dock måste det medges att det år stora biologiska skillnader mellan flugor och människor. Vi har dock argumenterat att många aspekter går att undersöka, dit hör verkningsmekanismer, skillnad mellan biverkansdos och behandlingsdos, samt många grundläggande vetenskapliga frågor.

Under året har vi därför validerat modellen, för att få den acceptabel som utgångspunkt för att hitta substanser som kan utvecklas till nya läkemedel. Vi har utvecklat tidigare  data som visar att plasmaproteinet SAP, som binder till alla former av amyloidtrådar, hämmar den nervskadande effekten, och vi håller på att utveckla tillförlitliga testsystem för drogkandidater.

Viktigast är dock försök i samarbete med professor Fredrik Almqvist, Kemiska institutionen i Umeå, för att hitta substanser som hämmar amyloidbildning eller dess toxiska effekter. Vi håller på att förfina ett testsystem för detta, och har identifierat en handfull substanser som har en viss effekt på flugorna. De är alla sämre än diflunisal och diclofenax, som prövas kliniskt. Men försöksupplägget innebär att när man får napp med någon substans, så går man vidare med kemiska syntes eller modifiering. Efter några generationer av kemiska modifieringar kan man på detta sätt få fram substanser med god behandlingseffekt, och man kan även ’syntetisera bort’ delar av molekylen som står för biverkningar. Det sistnämnda är särskilt viktigt för preparat, som vi tror kräver livslång behandling.

Målsättningen är att under året få fram åtminstone en substans, som har så god effekt att den är intressant för kliniska försök på människa enligt det regelsystem som gäller.

Forskningsrapport 2008
Ole Suhr

Vi har fortsatt vårt arbete med genetiska markörer för sjukdomen, inklusive undersökning av mitokondrie DNA som har stor betydelse för hur vi tar hand om syre när cellen alstrar energi. Det visar sig att patienter med sen debutålder av sjukdomen (det vanligaste) oftast har samma grupp av mitokondrie-gener som är vanlig i befolkningen, medan de som insjuknar tidigt i sjukdomen oftast tillhör de som har en mera ovanlig typ av mitokondrie-DNA.

Då vi ärver vårt mitokontrie DNA från vår mamma, undersöker vi om det kan ha betydelse för att patienter med FAP-sjuk mamma ofta får sjukdomen tidigare än om dom har en FAP-sjuk pappa.

I samarbete med franska forskare har vi dessutom undersökt dels genomslag av FAP-genen, dels om mutationen är svensk eller eventuellt europeisk (fransk - portugisisk). Vi påvisar stora skillnader i genomslag av genen mellan Piteåområdet och Skellefteå. Dessutom, som väntat, tidigare debut av sjukdomen hos dom som får anlaget från sin mamma. Varför det finns dessa skillnader vet vi inte, men vi arbetar med detta, bl.a. med andra möjliga gener som påverkar sjukdomen.

Ett annat område som vi undersöker intensivt är förekomst av olika fibrilltyper (hellängd ”fullength”, blandad hellängd och förkortade ”fragmented” transthyretin-fibriller) i vävnader från FAP-patienter. Vi påvisar att man har samma fibrilltyp i alla vävnader, alltså samma fibrilltyp i hjärtat som i fettvävnad. Dessutom att typen av fibriller är kopplad till ålder vid insjuknande i sjukdomen, och även till hjärtpåverkan. Detta ger möjlighet för bestämning av fibrilltyp i kroppen på en vanlig fettbiopsi (även fettaspiration med en grov kanyl verkar fungera), och dessutom att vi lätt kan följa patienterna dels för att se om fibriltypen ändrar sig (vi tror inte det) dels för att kunde relatera fibrilltyp till hjärtkomplikationer, speciellt hjärtförtjockning efter transplantation.

Då hjärtkomplikationer till sjukdomen har visat sig vara ett stort och oväntat problem efter levertransplantation har vi undersökt förekomst av hjärtkomplikationer och hur vi kan detektera hjärtkomplikationer under året. Vi har undersökt det autonoma (icke viljeberoende nervsystemets) påverkan på hjärtat. Vi visar att det autonoma nervsystemet inte försämras efter transplantationen, men att det uppträder hjärtrytmstörningar hos många patienter kortare eller längre tid efter transplantationen, som gör att den vanligaste metoden (hjärtrytmundersökning) inte är pålitlig hos FAP-patienter efter transplantation.

För att underlätta diagnostiken av hjärtkomplikationer, undersökte vi blodprover för vanliga markörer av hjärtpåverkan. Vi såg då att BNP, ett ämne som använts som markör vid hjärtsvikt var mycket känsligt och kunde påvisa hjärtpåverkan med samma säkerhet som hjärtechocardiografi. Däremot var markörer för hjärtinfarkt sällan positiva. Vi tror att BNP är en mycket lämplig markör för hjärtkomplikation vid FAP, och den är dessutom lätt att följa,

t e x efter transplantation.

Ögonkomplikationer är ju inte ovanliga vid FAP, och då transthyretin bildas lokalt i ögat, är det inte förvånande att komplikationer uppträder efter transplantation. Det som man bör vara uppmärksam på är tryckökning i ögat efter transplantation. Detta ger inga symptom innan man har fått bestående skada på ögat. Vi rekommenderar därför kontroll av trycket i ögat regelbundet efter transplantation.

Det är välkänt, att symptomen vid FAP skiljer sig mellan t e x svenska och japanska patienter. Speciellt är diarré ett vanligt och tidigt förekommande symptom vid FAP hos japanska patienter. Vi undersökte om detta kunde förklaras av olika gener som påverkar tarmens rörelser. Vi såg då att japanska patienter och befolkning har en något avvikande typ av gen som påverkar tarmens rörlighet än den man ser i Sverige. Det fanns också ett samband mellan denna avvikelse och förekomst av diarré hos patienterna, men relativt få svenska patienter med tarmkomplikationer försvårade bedömningen.

Bland ”övriga arbeten” finns bokkapitel i en internationell bok om Transthyretin, där vi skriver ett kapitel om levertransplantation för FAP. Dessutom en vägledning för läkare om diagnostik av FAP och andra amyloidossjukdomar. Finns på nätet www.amyloidosis.org

Uppgifter om publicerade arbeten finns på FAMY-Norrbottens kansli.

Forskningsrapport 2008

Anders Olofsson

Depositioner av proteiner och peptider i form av amyloid är idag kopplat till över 25 olika syndrom där Alzheimers och Creutzfeldt-Jakobs sjukdom är några av de mest kända. Familjär amyloidos med polyneuropati (FAP) orsakas av att proteinet transthyretin (TTR) kan anta en felaktig konformation vilket slutligen leder till aggregering samt bildning av amyloid. 

 
Den familjära varianten orsakas av punktmutationer vilket minskar proteinets stabilitet och ökar dess benägenhet att aggregera.  Den vävnadsskadande mekanismen orsakad av aggregerat TTR är idag inte helt klarlagd. Att större mängder amyloid orsakar en nedsatt funktion i de drabbade organen är troligt. En mer akut och nervskadande effekt har dock nyligen påvisats för TTR och i analogi med bl.a. Alzheimers sjukdom, orsakas denna av relativt små aggregat i jämförelse med de amyloida inlagringar som kan ses i vävnad.
           

Genom vår forskning har vi upptäckt att en giftig variant av TTR utgörs av en sammansättning som är mycket lik dess naturliga form. Att ett protein associerat med amyloid kan orsaka en celldödande effekt utan en aggregering är även ett helt unikt fynd och mycket intressant ur ett bredare perspektiv. Att utröna om denna form är relevant även in vivo(=i FAP-patienter) ser vi som en mycket viktig frågeställning. Strukturella studier av amyloiders sammansättning och arkitektur förhindras av dess fiberlika struktur. Detta är den främsta anledningen till att man i dagsläget bara har en begränsad förståelse för amyloidens struktur och bildning. Genom vårt fynd där en giftig variant av TTR kan hållas i ett icke-aggregerat stadium så möjliggörs analysmetoder där man i detalj kan studera och identifiera de strukturella förändringar som ligger bakom dess patologiska egenskaper. En sådan information är till stor hjälp i en fortsatt design av inhibitorer.

Forskningsrapport 2008
Per Westermark

Studier av skillnaden mellan de två former av familjär transthyretinamyloid 

Vi har tidigare beskrivit att familjär transthyretinamyloid kan förekomma i två former som skiljer sig åt beträffande vilka subenheter de är uppbyggda av. Den ena formen innehåller endast helt transthyretin (TTR) (127 aminosyrarester) medan den andra till stor del består av TTR-fragment som startar runt aminosyra 50, vanligen 46, 49 och 52. Dessa två former av amyloidfibriller ser olika ut och har något olika egenskaper. Amyloidtypen verkar vara densamma för olika organ i en och samma patient men däremot skilja sig mellan patienter.

Vi har föreslagit att mekanismen bakom fibrillbildningen är olika i dessa två typer av amyloider samt att sjukdomens manifestationer och utveckling skiljer sig åt mellan dessa patientgrupper. För att undersöka detta har vi studerat amyloid från bukfettsbiopsier som vi erhåller genom ett samarbete med Prof. Ole Suhr i Umeå. Vi har tidigare rapporterat att vi funnit ett samband mellan amyloidtyp och skillnader i ålder vid sjukdomsdebut samt hjärtsymptom. Patienter med fragment av TTR i amyloiden har i genomsnitt en högre ålder (medel 67 år) vid sjukdomsdebut än patienter vars amyloid endast innehåller hela transthyretin-molekyler (medel 45 år). Patienter med fragment har även större mängd amyloidinlagring i hjärtat än den andra gruppen (interventrikularseptums tjocklek på 19 mm mot 12 mm), vilket ger dem en större benägenhet för restriktiv kardiomyopati. Detta är troligen den första studie som sammankopplar skillnader i fibrillkomposition med variationer i sjukdomsmanifestation. Vi har under året fortsatt att arbeta med denna studie och den är nu publicerad.

För att klargöra om sambandet mellan kardiomyopati och amyloid innehållande fragment gäller för familjär transthyretin amyloidos i allmänhet eller är begränsat till den vanligaste mutationen i Sverige (Val30Met) har vi inlett ett samarbete med Prof Claudio Rapezzi i Bologna i Italien. Vi har under året undersökt ett antal patienter med olika mutationer i transthyretin-genen, vilka alla har lidit av kardiomyopati. Intressant nog innehöll alla dessa patienters amyloid fragment av TTR. Detta tyder på att det nämnda sambandet är giltigt generellt för ärftlig transthyretin amyloidos. Studien har emellertid bara påbörjats och ytterligare patienter kommer att undersökas framöver.

Progression av kardiomyopati efter lever-transplantation är ett problem som drabbar en del patienter. Varför vissa drabbas och andra inte är okänt. Orsaken till den progressiva kardiomyopatin är troligen att normalt, icke-muterat (vildtyp) TTR fortsätter att lagras in i amyloiden efter transplantationen. Vår hypotes är att det framförallt kan vara patienter med amyloid innehållande fragment som drabbas. Vi har därför undersökt bukfettsbiopsier från patienter med mutationen Val30Met från norra Sverige, dels sådana med amyloid innehållande fragment och dels sådana utan. Vi har funnit att vildtyps TTR fortsätter att lagras in i båda grupperna men att proportionen vildtyp efter transplantation är mycket högre bland patienter vars amyloid innehåller fragment av TTR. Det verkar alltså som att vildtyps-TTR av någon anledning lättare bygger på amyloid bestående av fragment än sådan av endast helt TTR. Dessa resultat tyder på att det är just patienter med fragment som är i riskzonen för progressiv kardiomyopati efter transplantation, dels då vildtyps TTR lättare binder in till denna typ av amyloid men även pga att dessa patienter redan från början har mer amyloid i hjärtat (se ovan). Dessa resultat kommer att sammanställas till ett manuskript inom kort.

Vi har tidigare rapporterat att vi i samarbete med Dr. Arie Stangou i London har undersökt patienter med mutationen Thr60Ala. Dessa patienter är intressanta då proportionen vildtyp/mutant TTR kan undersökas inte bara i de TTR-molekyler som är hela utan även fragmenten. Detta är inte fallet för Val30Met-mutationen då denna är lokaliserad N-terminalt om klyvningsstället och alltså klyvs bort. Vi har tidigare beskrivit hur vi upptäckt att vildtyps-proportionen är högre i den transplanterade patienten jämfört med den icke-transplanterade men att denna skillnad framförallt återfinns bland de hela TTR-molekylerna, medan det bland fragmenten inte uppvisades lika stor skillnad.

Vårt arbete med att vidareutveckla metoder för diagnostik av systemisk amyloidos fortsätter. Detsamma gör vårt upplysningsarbete eftersom kunskapen om amyloidos och hur sjukdomarna diagnostiseras är bristfällig. Här spelar också vårt arbete med EU-projektet ”Systemic Amyloidoses in Europe (EURAMY; www.EURAMY.org) en viktig roll. Detta projekt har redan lett till ett ökande samarbete i Europa, inte minst inom området familjär amyloidos.

Forskningsrapport år 2008
Urban Wiklund 

Hög hjärtfrekvensvariabilitet  –  autonom styrning eller svårupptäckt förmaksarytmi?

Patienter med  sjukdomen familjär amyloidos med polyneuropati (FAP) har ofta mycket oregelbunden hjärtfrekvens på grund av förmaksarytmier och överledningsrubbningar, vilket försvårar bedömningen av hur nervsystemet styr hjärtats funktion. I flera tidigare studier (ingående i Rolf Hörnstens avhandlingsarbete) har vi funnit att många FAP-patienter har förhöjd hjärtfrekvensvariablitet på grund av svårupptäckta förmaksarytmier, med vilket vi avser arytmier som ofta inte upptäcks vid sedvanliga arytmianalyser av Holter-EKG samt andra EKG-registreringar. Hos några patienter med mycket hög hjärtfrekvensvariabilitet var det dock svårt att avgöra om den höga variabiliteten var orsakad av en onormalt utlöst förmaksrytm, eller om det bara berodde på mycket hög andningsrelaterad hjärtfrekvensvariabilitet. 

Syftet med detta projekt är att studera hur hjärtfrekvensen hos patienter med FAP samvarierar med andningsmönster och slag-till-slag variationen i blodtryck. Det finns ingen tidigare studie där både hjärtfrekvens- och blodtrycksvariabilitet har analyserats hos denna patientgrupp.

Den huvudsakliga målsättningen är att utveckla nya matematiska analysmetoder för att studera samvariationen i två olika signaler. Vi har tagit fram en metod som är anpassad för analys av data från individer med mycket oregelbunden hjärtfrekvensvariabilitet och oregelbunden andningsfrekvens. 

Hittills har vi analyserat data från 6 FAP-patienter med hög hjärtfrekvensvariabilitet som vi misstänkte berodde på svårupptäckta förmaksarytmier, vilka jämförts med 6 FAP-patienter med låg hjärtfrekvensvariabilitet och 12 åldersmatchade friska försökspersoner. De resultat som vi hittills fått fram visar att denna metod gör det lättare att särskilja individer med normal hjärtfrekvensvariabilitet från dem som har förhöjd hjärtfrekvensvariabilitet beroende på förekomsten av svårupptäckta förmaksarytmier. 

Vi har tidigare redovisat delresultat som ett konferensbidrag och har under 2008 skickats ett manus för publicering i en medicinteknisk tidskrift. Manuset håller på att omarbetas för ny inskickning och vi har lagt till en jämförelse med ytterligare en matematisk analysmetod.

Register avseende forskningsrapporter för år 2007

Erik Lundgren - Redovisning för projetet Amyloidbildning av transthyretin - metod för utveckling av hämmade läkemedel
Ole Suhr - Risk för anlagsbärare att utveckla FAP beroende på var man bor och vem man ärver anlaget av
Per Westermark - Fortsatta undersökningar av familjär amyloidos av transtyretinnatur
Urban Wiklund och Rolf Hörnsten - Långtidsuppföljning av hjärtfrekvensvariabilitet hos levertransplanterade......
Intissar Anan - Amyloidinlagringar hos danska, finska,  japanska och svenska amyloidos patienter

Forskningsrapport 2007
Erik Lundgren

Redovisning för projektet Amyloidbildning av transthyretin - metod för utveckling av hämmande läkemedel.                 

                      I tidigare redovisning har jag angivit varför vi valt bananfluga (Drosophila melanogaster) för våra studier. Syftet med projektet är att förstå hur transthyretin (TTR) bildar toxiska aggregat och amyloidfibirller och hur dessa åstadkommer skada på perifera nerver. Vidare att hitta läkemedel som antingen hämmar bildning av aggretat, löser upp dem eller hämmar deras toiska effekter. Jag har även gjort en redogörelse för varför det inte har varit möjigt att får goda resultat genom test på däggdjur, vilket annars är regeln när nya läkemedel skall utprövas.

Efter revision grundat på mycket goda påpekanden från granskarna har det första arbetet kommit i tryck om bananfluga som modell för Familjär amyloidos med polyneuropat (FAP), arbetet bifogas (arbete nr 2).

.                     Arbetet kan sammanfattas på följande sätt.

1)      Vi har karaktäriserat tre genetiskt modifierade flugstammar med mutationer av TTR.   

2)      Enbart stammar med muterat TTR får aggregat och neurologisk påverkan, under det att icke muterat protein inte ger symptom. Detta är ett viktigt fynd och ett oberoende bevis för att mutationen är en nödvändig förutsättning för utveckling av toxiska aggregat.

3)      Vi har visat att mängden aggregat är beroende av mängden protein som bildas. Om proteinmängden är stor fås lägre grad av symptom. Tolkningen är att bildning av amyloid, som är en slags kristall i fiberform, leder till en högt ordnad struktur, som inte är skadlig, utan möjligen ett skydd. Det är lågmolekylära aggregat som är farliga, och det är bildning av dessa eller deras toxiska effekter som bör vara målet för läkemedelsutveckling.

4)      De viktigaste symtomen är svårigheter att klättra, att flyga och nedhängande vingar. Dessutom förkortas livslängden. Nedhängande vingar (dragged wings) kommer redan efter några dagar och är en utmärkt avläsningspunkt för test av toxiska aggregat.

I det fortsatta arbetet har vi framställt flugor med genen för det humana proteinet Serum amyloid protein P (SAP). Detta protein har en okänd funktion, men klibbar fast på alla typer av amyloidfibriller. I Karin Anderssons avhandling visades att SAP hämmade toxisk effekt av amyloid, men inte bildning av amyloid. Resultatet är kontroversiellt, då andra har data som visar att det är gynnsamt att avlägsna SAP från amyloid. Vi har under året framställt ett stort antal flugstammar som korsas med TTR-flugor. Våra data visar att SAP på ett dosberoende sätt hämmar nedhängande vingar. Detta fynd kan ha betydelse för att förstå att bara omkring 5% med TTR-mutationer utvecklar sjukdomen. Dvs SAP kan vara en av flera modifierande vävnadsfaktorer som styr sjukdomsförloppet och bananfluga är en utmärkt modell för att finna sådana faktorer. Dessa data sammanställs tillsammans med Anderssons tidigare  för närvarande för att ingå i Malgorzata Pokrzywas avhandling (arbete nr 3).

Vi har tidigare visat att Diflunisal, som stabiliserar TTR och hindrar aggegatbildning hämmar nedhängande vingar. Detta har tagits som utgångspunkt för ett testsystem av drogkandidater. Sålunda görs i samarbete med Anders Olofsson, UCMP och Fredrik Almqvist, Org. Kemi test på flera 100 substanser för sin förmåga att hindra amyloidbildning i provröret. Ett system har utvecklats för att sedan testa kandidatsubstanser på cellkulturer för att testa koncentrationer lämpliga att blanda i flugmaten. För närvarande har fem intressanta substanser identifierats, som kommer att testas på flugor inom kort. Även dessa data sammanställs för närvarande för att ingå i Malgorzata Pokrzywas avhandling (arbete nr 6).

I flugor har vi i samarbete med prof. Rafael Cantera, Zoologiska inst, Stockholms universitet, visat att flugor bildar regelbundna strukturer i form av mikrosfärer, som ställvis även antar de dimensioner som amyloid har. Dessa uppkommer sent i flugornas livscykel. I preliminära experiment har vi sett att redan efter några dagar som vuxen fluga är extrakt från flugorna höggradigt toxiska, under det att när de organiserade sfärerna ses, så finns ingen toxiska faktor i flugorna. Vår hypotes är att flugorna har en varitant av amyloidbildning för att desarmerar toxiska lågmolekylära aggregat. Modellen kan utvecklas till ett komplement till studier av de förändrade vingarna för att testa drogkandidater. Även dessa data sammanställs för närvarande för att ingå i Malgorzata Pokrzywas avhandling (arbete nr 4).

Våra data har under året presenterats för EU-konsortiet Euramy, där vi deltar. Vid möten i Berlin och Rom mottags våra undersökningar mycket positivt. Vi ser fram mot att kunna utveckla vår modell mot mer riktade försök på drogkandidater under kommande år.

Forskningsrapport 2007

Ole Suhr

Risk för anlagsbärare att utveckla FAP beroende på var man bor och vem man ärver anlaget av.

Vi har fått 6 artiklar accepterade för publicering under 2007 och fram till dags datum.

Vi har ett projekt inom EU för sällsynta sjukdomar, EURAMY, där vi i samarbete med franska forskare har undersökt svenska patienter, dels med avseende på risk för anlagsbärare att utveckla sjukdomen, dels om arvsanlaget för sjukdomen är importerad eller om förändringen av arvsanlaget uppkom inom vår population i Norra Sverige.

I två artiklar har vi visat att risken för att utveckla sjukdomen beror dels på var man bor ( Skellefteå versus Piteå området) dels om man ärver anlaget från sin mamma eller sin pappa. I Skellefteåområdet insjuknar man tidigare än i Piteåområdet, och genomslagkraften av anlaget är sålunda starkare i Skellefteå än i Piteå. Dessutom ökar genomslagskraften  om man ärver anlaget från sin mamma.

Vi har fortsatt vår utvärdering av transplantation som behandling. Vi har dels utvärderat alla patienter som har transplanterats på Huddinge sjukhus, inklusive japanska patienter. Utfallet är ungefär som det vi tidigare har rapporterat, med en klar förbättring av resultaten under tiden eftersom vi har blivit bättre på att värdera risken för den enskilda patienten. Vi har också värderat resultatet efter levertransplantation, men här med avseende på nervsystemets påverkan av hjärtfunktionen. Det finns rapporter om en förbättring av nervfunktionen efter transplantation. Vi visar emellertid, att detta beror på förändringar i hjärtats rytm, förändringar som är svåra ett hitta på vanligt EKG, men som vi kan detektera på 24 timmars undersökningar av hjärtrytmen, eller med en ny teknik, såkallad ”wavelet coherence”, där man kan påvisa dessa svårfångade förändringar. Detta har betydelse för utvärdering av behandling för sjukdomen, då man i stor utsträckning använder teknik som inte fångar dessa hjärtrytmer när man utvärderar behandlingsresultat.

Vi har också undersökt om nya markörer för hjärtpåverkan är lämpliga för undersökning av hjärtpåverkan vid FAP. Vi har hittat att en markör som heter pro-BNP fungerar mycket bra, och att den kan vara en bra markör för att följa effekt av behandling, och även kunna detektera patienter med tidig hjärtpåverkan, innan vi ser det med andra undersökningar såsom echo undersökning.

Det kan tilläggas, att vi har avslutat intaget av patienter i den ena av våra pågående läkemedelsprovningar, medan vi fortfarande håller på med att ta in patienter i den andra studien. Vi räknar med att ha de första resultaten under våren 2010.

Information om publikationerna finns på FAMY-Norrbottens kansli.

Forskningsrapport 2007

 Per Westermark 

Fortsatta undersökningar av familjär amyloidos av transtyretinnatur

Arbetet har i stort sett kunnat följa forskningsansökans plan.

Vi beskrev tidigare att familjär transthyretinamyloid, som den uppträder i hjärtat, kan förekomma i två former som skiljer sig åt beträffande utseende och fördelning i hjärtat. Vi fann då att den ena formen innehåller helt transthyretin (TTR) (127 aminosyrarester) medan den andra till stor del består av TTR-fragment, som startar runt aminosyra 50, vanligen 46, 49 och 52. Amyloidfibrillerna ser olika ut hos dessa former och amyloiden har något olika egenskaper. Vi har därför föreslagit att fibrillbildningsmekanismen också kan vara olika.  

Hjärtamyloid är svår att studera och därför har vi jämfört sådan amyloid med inlagringar i underhudsfettvävnad, som lätt kan biopseras. Vi har nu funnit att sammansättningen hos amyloid i subcutis är densamma som i hjärtat. Detta har möjliggjort ett stort pågående samarbetsprojekt mellan oss och prof. Ole Suhr i Umeå, som avser att studera om de två beskrivna variationerna i amyloidsammansättning också avspeglar skillnader i hur amyloidossjukdomen manifesteras och hur den utvecklas. Vi har under året studerat amyloid i underhudsfettvävnad från 33 patienter. Hos 12 av dessa bestod fibrillen av helt TTR medan 21 hade TTR-fragment. Det visade sig att de med helt TTR var betydligt yngre (medeltal 41 år) än de med fragment (65 år). Progressiv amyloid cardiomyopati är ett problem hos en del patienter med svensk FAP men varför endast vissa drabbas är oklart. Vi fann i denna studie att individer med fragment-TTR hade signifikant mer cardiomyopati än den andra gruppen, mätt som interventrikularseptums tjocklek (19.5±4.0 mm respektive 11.3±4.0 mm; p<0.0001). Sjukdomsdurationen var endast något längre i fragmentgruppen och är därför inte orsaken till skillnaden. Detta är troligen den första studie som kopplar samman skillnader i proteinkomposition med variationer i fenotyp, d.v.s. sjukdomsmanifestation. Dessa studier har nu satts samman i ett manuskript som är klart för submission.

Progression av cardiomyopati kan också ske efter transplantation och förklaras sannolikt av addition av vildtyps-TTR till de befintliga inlagringarna. Det går inte att få biopsimaterial från hjärta för sådana studier och därför har vi använt amyloid, extraherad från bukfettsbiopsier. Eftersom det N-terminala fragmentet, som spjälkas bort från TTR hos individer med fragment-TTR, innehåller den mutanta delen, går det endast att studera fullängdsproteinet. Vi kan visa att detta innehåller mycket mer vildttypsprotein hos individer som levertransplanterats och detta i båda patientgrupperna. Detta visar alltså att TTR med normal primärstruktur fortsätter att lagras in efter transplantation också i andra organ än hjärta. Dessa resultat är ännu inte helt sammanställda och ytterligare biopsimaterial behövs för att göra statistiken säker. 

Vi har också samarbete med dr. Arie Stangou i London och därifrån har vi fått amyloidmaterial från patienter med en annan mutation, TTRT60A. Vi fann att också vid denna form är TTR kluvet och domineras av fragment på samma sätt som vid TTRV30M. Emellertid är denna mutation alltså belägen C-terminalt om klyvningsstället till fragment och förhållande mellan vildtypsprotein och mutant protein kan studeras även i fragment. Vi fann i fullängdsproteinet ökad mängd vildtyps-TTR efter transplantation. Mer förvånande var att fragmenten inte visade denna ökning. Hur detta fynd kan tolkas är ännu oklart. Resultaten är sammanställda i ett manuskript, se nedan. 

Vårt arbete med att vidareutveckla metoder för diagnostik av systemisk amyloidos fortsätter. Detsamma gör vårt upplysningsarbete eftersom kunskapen om amyloidos och hur sjukdomarna diagnostiseras är bristfällig. Här spelar också arbetet med EU-projektet ”Systemic Amyloidoses in Europe (EURAMY; www.EURAMY.org) en viktig roll. Detta projekt har redan lett till ett allt ökande samarbete i Europa.

Forskningsrapport 2007

Urban Wiklund och Rolf Hörnsten
Övriga medarbetare: Ole Suhr, Bert-Ove Olofsson

 
Långtidsuppföljning av hjärtfrekvensvariabilitet hos levertransplantaterade patienter med familjär amyloidos med polyneuropati

Introduktion 

Målsättningen med vårt projekt var att analysera korttidsregistreringar av hjärtfrekvensvariabilitet utförda före och efter levertransplantation. Avsikten med projektet var att undersöka om HRV-undersökningarna visar tecken på förbättring eller försämring i den autonoma funktionen efter levertransplantationen. 

Det finns en tidigare studie där korttidsregistreringar har analyserats efter levertransplantation (Suhr O,. J Intern Med. 1997). Vår målsättning i denna studie var dels att undersöka ett större patientmaterial, dels även göra en långtidsuppföljning efter levertransplantation. Hjärtfrekvensvariabilitet vid långtidsuppföljningar efter levertransplantation har inte analyserats i någon tidigare studie.  

Hjärtfrekvensvariabilitet (HRV, heart rate variability)

Den signal som uttrycker hjärtfrekvensen (beräknad ur RR-intervallen i ett EKG) är beroende av ett flertal fysiologiska rytmers samtidiga inflytande på sinusknutans impulsbildning, där det autonoma nervsystemet har en viktig roll för finjusteringen av tidpunkten för varje nytt hjärtslag. I början av 1980-talet introducerades spektralanalys som en metod för att analysera slag-till-slag variationen i hjärtfrekvens. Med denna metod bearbetas matematiskt tidsavsnitten mellan de enskilda hjärtslagens signaler i EKG till ett frekvensspektrum. Detta innehåller ett kvantitativt mått på totala variabiliteten (vilket motsvarar signalens varians) i det analyserade EKG-avsnittet, men visar också i vilken utsträckning denna variabilitet är beroende av modulering via de sympatiska respektive parasympatiska delarna av nervsystemet. 

Analysen av variabiliteten inom det s.k. lågfrekvensområdet (LF) från 0.04-0.15 Hz har associerats med den baroreflex-medierade regleringen av blodtrycket, vilken återspeglar både sympatisk och parasympatisk aktivitet i den autonoma styrningen av det kardiovaskulära systemet. Förändringar av den lågfrekventa variabiliteten i HRV efter förändringar av kroppsläget, t.ex. efter passiv tippning till upprätt kroppsläge, har i vissa studier föreslagits kunna användas som en markör av förändringar i sympatisk aktivitet. De högfrekventa (HF) svängningarna inom frekvensområdet 0.15-0.50 Hz återspeglar hos de flesta friska individer andningsynkrona förändringar i hjärtfrekvens, och används ofta som ett index på parasympatisk aktivitet. 

Material och metoder 

Vi har undersökt 57 FAP patienter (29 män och 28 kvinnor) med DNA- och biopsiverifierad förekomst av FAP Patienterna undersöktes med avseende på korttids-HRV (mätt i liggande och efter passiv tippning till upprätt position) 

a) i samband med utredning inför en eventuell levertransplantation
b) som korttids-uppföljning, upp till 30 månader efter levertransplantation,
c) som långtids-uppföljning mer än 42 månader efter levertransplantation. 

Som kontrollgrupp valdes 96 friska försökspersoner, vilka undersökts med samma metodik och utrustning. 

Resultat och diskussion 

Vi har tidigare funnit att reducerad hjärtfrekvensvariabilitet är ett vanligt fynd hos patienter med FAP. Även resultaten i denna studie visade en minskad autonom funktion hos dessa patienter jämfört med hjärtfriska kontroller både före och efter levertransplantation. Liksom tidigare studier av Holter-EKG:n visar denna studie att patienter med ”Skelleftesjukan” fortsätter att utveckla hjärtarytmier även efter levertransplantation. Däremot verkar levertransplantation bromsa upp den snabba försämring i det autonoma nervsystemets reglering av hjärtrytmen som sker hos obehandlade patienter. 

Sammanfattning

Denna studie är den första långtidsuppföljningen (mer än 3 år) av s.k. hjärtfrekvensvariabilitet hos levertransplanterade patienter med familjär amyloidos med polyneuropati (FAP). Hjärtfrekvensvariabilitet är en metod att studera hur hjärtfrekvensen varierar från hjärtslag till hjärtslag. I studien analyserades data från 57 patienter som undersökts i liggande samt efter tippning till upprätt position både före och efter levertransplantation. Avsikten med projektet var att undersöka om HRV-undersökningarna visar tecken på förbättring eller försämring i den autonoma funktionen efter levertransplantationen. 

Studien ingår som det femte delarbetet i Rolf Hörnstens doktorsavhandling, som han försvarade i november 2007. Studien visar att patienter med ”Skelleftesjukan” fortsätter att utveckla hjärtarytmier även efter levertransplantation. Däremot verkar levertransplantation bromsa upp den snabba försämring i det autonoma nervsystemets reglering av hjärtrytmen som sker hos obehandlade patienter.  Manuskriptet håller på att gås igenom för komplettering och vår förhoppning är att det ska vara klart för inskickning senast i april 2008.

Forskningsrapport 2007

Intissar Anan

Amyloidinlagringar hos danska, finska, japanska och svenska amyloidospatienter

Under år 2007 har jag jobbat med att färdigställa ett manuskript med titel Pathways of amyloid toxicity, an immunohistochemical investigation of advanced glycation end products, their receptor and NFKB activation and apoptosis. 
Samtidigt har jag jobbat med projektet Heat shock proteiner och high mobility group protien-1 och dess roll i patogenesen av FAP där jag har hunnit analysera en hel del resultat men det återstår dock några experiment som jag planerar att utföra under våren 2008. Nedan följer en sammanfattning av resultaten. 

1. I manuskript ”Pathways of amyloid toxicity, an immunohistochemical investigation of advanced glycation end products, their receptor and NFKB activation and apoptosis” undersöktes material från Danska, Finska, Japanska och Svenska amyloidos patienter. Resultaten visade på att amyloid inlagringar var massiva i hjärta, njure och gastrointestinal kanal hos alla patienter. AGE och RAGE hittades i hjärta , njure, rektum, tarm och blindtarm. AGE, RAGE var väl kolocaliserade med amyloid inlagringar. Ingen NFKB aktivering eller induktion av apoptos kunde detekteras. Som konklusion kan dras att AGE, RAGE var associerade med amyloid inlagringar i all material oavsett vilken amyloidos typ det var. Däremot apoptos och NFKB aktivering visade inte entydiga resultat vilket kan betyda att ytterligare pathways för AGE/RAGE och amyloid toxicitet verkar fungera på sida av NFKB aktiverade pathways.  

2. Heat shock proteiner och high mobility group protien-1 och dess roll i patogenesen av FAP projektet fortgår. Det har analyserats resultat gällande Hsp 60, Hsp 70 och clusterin. Resultaten är mycket intressanta och lovande men det återstår en del experiment som kommer att utföras under våren

Register avseende forskningsrapporter år 2006

Erik Lundgren  -  Amyloidbildning av transthyretin - metod för utveckling av hämmande läkemedel. 
Per Westermark, Anna Ybo  -  Fortsatta undersökningar av familjär amyloidos av transthyretinnatur
Anders Olofsson  -  Studier av transthyretins cytotoxictet
Elisabeth Sauer Eriksson  -  Struktuella studier av transthyretin
Ole Suhr  -  Studier av störningar i hjärtat vid FAP  samt behandlingstudier med läkemedel för att stabilisera transthyretin
Urban Viklund, Rolf Hörnsten  -  Hjärtfrekvensvariabilitet före och efter levertransplantation hos patienter med familjär amyloidos med polyneuropati
Malin Olsson - Mitokondriernas haplogrupper i norr Sverige och sambandet mellan dessa och debutåldern för FAP
 

Forskningsrapport (2006)

Malin Olsson 

Mitokondriernas haplogrupper i norra Sverige och sambandet mellan dessa och debutåldern för FAP

Forskningsmedlen har använts för studier av mitokondriernas (utgör cellernas ”kraftverk” och utvecklar värme, ärvs från modern) betydelse för debutåldern för FAP. Pengarna har gått till analyskostnader för sekvensering av kontrollregionen hos mitokondrier hos FAP-patienter med tidig (under 36 år) och sen (över 76 år) sjukdomsdebut.  Detta kallas att man typar haplogrupperna i mitokondriegenomenet. På så vis kan man se om det finns någon genetisk variation i mitokondrierna som kan påverka och förklara de stora skillnaderna i debutåldern som finns. Och det verkar faktiskt vara så!

Resultaten har presenterats som en poster (skärm med text och figurer) vid en kongress i Boston (resulterade i ett personligt forskarpris) och i form av en artikel som ska skickas till en tidskrift för publikation

Forskningsrapport 2006

Urban Wiklund, Rolf Hörnsten
Övriga medarbetare: Steen Jensen, Ole Suhr

Hjärtfrekvensvariabilitet före och efter levertransplantation hos patienter med familjär amyloidos med polyneuropati

Sammanfattning

I denna pågående studie studerar vi hur hjärtfrekvensen varierar från hjärtslag till hjärtslag hos patienter med familjär amyloidos med polyneuropati (FAP). Vi håller på att analysera data som samlats in i samband med två olika undersökningar före och efter levertransplantation, dels vid mätning under ett dygn med s.k. Holter-registrering, dels vid en undersökning i liggande samt efter tippning till upprätt position. Avsikten med projektet var att undersöka om HRV-undersökningarna visar tecken på progress eller regress i den autonoma dysfunktionen efter levertransplantationen.

Dygnsregistreringar har analyserats från 21 FAP- patienter med DNA- och biopsiverifierad förekomst av FAP. Dessa patienter har undersökts före levertransplantation, vilket jämförts med undersökningar utförda upp till två år efter levertransplantation.

Korttidsregistreringar har analyserats från 57 FAP patienter med DNA- och biopsiverifierad förekomst av FAP . Dessa patienter har undersökts före levertransplantation, vilket jämförts med undersökningar utförda upp till tio år efter levertransplantation.

Under året har vi främst arbetat med att analysera hjärtfrekvensvariabilitet från 24-timmarsregistreringar. Denna delstudie håller på att sammanställas i ett manuskript som skall vara klart för inskickning senast i juni 2007.  Datat från långtidsuppföljningar av korttidsregistreringar är klart för utvärdering och statistisk analys, och ett manuskript beräknas vara klart i september 2007.

Forskningsrapport 2006

Ole Suhr

Studier av störningar i hjärtat vid FAP  samt behandlingstudier med läkemedel för att stabilisera transthyretin

Publikationer under 2006.  

1.      Hörnsten R, Wiklund U, Suhr O, Jensen SM. Ventricular late potentials in familial amyloidotic polyneuropathy. J Electrocardiology 2006: 39(1):57-62.
Avser en undersökning av hjärtats elektriska impulser med en ny metod som kan påvisa så
kallade “late potentials”, sena störningar i hjärtats elektriska impulser som tyder på en instabilitet – retbarhet i hjärtmuskeln. Vi kunde påvisa att sådana störningar var vanliga hos våra patienter och att det kan ge upphov till snabb hjärtrytm som en del patienter har bekymmer med. Vi har fortsatt våra undersökningar med att analysera över 100  24-timmars EKG-undersökningar,  och materialet är under sammanställning.

2.      Lindqvist, P, Backman C, Suhr O, Olofsson BO, Waldenström A. Echocardiographic strain measurements reveal early signs of infiltrative cardiomyopathy. A Study on patients with familial amyloidotic cardiomyopathy. Eur J Echocard. . 2006: 7(1):22-30.
Avser en echocardiografisk undersökning av hjärtat. Med ny specialteknik kan man påvisa tidiga störningar i hjärtmuskeln. Dessa störningar kommer tidigare än andra tecken, såsom hjärtmuskelförtjockning. Vi fortsättar arbetet med blodprover för hjärtmuskelskada och hjärtsvikt. Detta arbete är färdigställt och inskickad för publicering.

3.      Sato T, Ando Y, Susuki S, Mikami F, Ikemizu S, Nakamura M, Suhr O, Anraku Kai T, Suico MA, Shuto T, Mizuguchi M, Yamagata Y, Kai H. Chromium(III) ion and thyroxine cooperate to stabilize the transthyretin tetramer and suppress in vitro amyloid fibril formation. FEBS Lett. 2006;23;580(2):491-6.
Avser en gemensam Japansk – Svensk undersökning av krom och dess förmåga att stabilisera transthyretin och på så sätt minska amyloidbildningen, samma princip som ligger bakom de två behandlingsstudier som nu pågår med dels nytt läkemedel, dels med Diflunisal. Det verkar som om dessa substanser stabiliserar transthyretin, och i provrör minskar även amyloidbildningen, men  vi vet fortfarande inte om det fungerar på patienter.

4.      Suhr OB, Lindqvist P. Olofsson B-O, Waldenström A, Backman C. Myocardial hypertrophy and function are related to age at onset in familial amyloidotic polyneuropathy. Amyloid, 2006;13:154-9.
Avser en undersökning av hjärtkomplikationer, speciellt förtjockning av hjärtmuskeln i förhållande till ålder vid insjuknandet. Det verkar som om åldern har en stor betydelse för hjärtkomplikationer, där äldre patienter har en klart större benägenhet att få en hjärtmuskelförtjockning jämfört med yngre. Vi vet inte vad som ligger bakom detta, men vi har ett projekt med Per Westermark i Uppsala, där vi undersöker typen av fibriller i vävnader, inklusive hjärtbiopsier, för att utröna om fibrilltyp har betydelse för utvecklingen av hjärtmuskelförtjockning.

Elisabeth Sauer-Eriksson

Årsrapport 2006

Anders Olofsson

Studier av transthyretins cytotoxictet

Familjär amyloidos med polyneuropati (FAP) orsakas av olika punktmutationer i plasma- proteinet transthyretin där idag över 80 olika mutationer är kända. Genom dessa förlorar proteinet delar av sin stabilitet vilket i sin tur leder till aggregering och slutligen resulterar i amyloida depositioner som återfinns i olika vävnader. De molekylära mekanismerna bakom proteinets egenskaper samt på vilket sätt aggregaten får en vävnadsskadande effekt är inte helt utrönt. Vi har fokuserat på flera delar i denna process där vi dels med NMR försöker förstå detaljerna bakom proteinets aggregerade egenskaper dels genom olika cellsystem försöker utröna specifikt vilka former som ger en cytotoxisk effekt.  

Studier av transthyretins cytotoxicitet:
Mekanismerna med vilka transthyretin samt även amyloid generellt ger en cytotoxisk effekt har studerats i detalj. Att den cytotoxiska effekten korrelerar med aggregering är ställt bortom allt rimligt tvivel. Uppgifterna om vad som utgör de mest potenta konformationerna samt vilka molekylära mekanismer som leder till dessa går dock brett isär. Fler och fler undersökningar pekar dock mot att de mest potenta aggregaten inte utgörs av den mogna amyloiden utan istället av förstadier bestående av lågmolekylära så kallade oligomerer. Vi har genom ett samarbete med Joel Buxbaum (La Hoya, Kalifornien) utvecklat en mycket robust cell-toxicitets assay. Våra gemensamma data pekar tydligt på att det är de lågmolekylära samansättningarna av transthyretin som ger den starkaste cytotoxiska effekten med ca 80% döda celler efter 48-72 timmar. Vi kan som första grupp även påvisa reaktivitet med transthyretin och en generell oligomer specifik antikropp som även känner igen oligomerer från Aβ-peptide (Alzheimer sjukdom) samt IAPP (associerad till amyloid vid diabetes typ II). Mekanismen med vilket proteinet kan anta denna cytotoxiska form, dess konformation samt på vilka sätt den kan inhiberas har vidare studerats. Man har tidigare vid studier på transgena möss visat att proteinets enda cystein (Cys10) verkar inhiberande för att få en sjukdomsfenotyp. Cystein 10 bildar in vivo även di-cystein bryggor som återfinns i mycket hög grad i amyloid depositioner. Vi har undersökt om dessa cysteinbryggor har en avgörande effekt för att aggregering skall ske, samt om de är nödvändiga för att få en cytotoxisk effekt. Vi kan dock tydligt visa att om cysteinet ersätts genom en punktmutation (Cys10Ser) så har detta ingen effekt på cytotoxiciteten vilket innebär att disulfidbryggor inte är ett krav för att erhålla cytotoxiska oligomerer. Dessa resultat kommer under våren att presenteras tillsammans med en större studie där effekten av olika modifikationer på cystein 10 undersökts. 

Utröna den process med vilket ett protein vecklas upp på atomär nivå:
NMR utgör ett mycket kraftfullt instrument för att i detalj studera molekylära förlopp. Vi har utvecklat en ny metod som gör det möjligt att följa de strukturella förändringar som sker när proteinet vecklas upp. Metoden bygger på att proteinet märks in med en isotop samt en specifik probe på specifik position. Med NMR kan sedan avståndet från denna probe till varje atom i proteinet följas. Denna information ger dock bara ett avstånd mellan probe och den specifika positionen varför vi har valt att sätta in prober på olika positioner och sedan med ”triangulering” även få riktningen och därmed den tredimensionella informationen. Vi har i dagsläget alla proteiner redo för analys och väntar för närvarande på att få tillgång till en av de två NMR maskiner som finns i världen som har de specifikationer som krävs för våra analyser.  

Proteas studier på transthyretin:
Amyloidstrukturer är genom sin icke kristallina och olösliga struktur svåra att studera vilket innebär att alternativa metoder måste användas. Vi har studerat amyloidfibrillens struktur med specifika proteaser. Dessa enzymer har en förmåga att klippa proteinets peptidbindningar på särskilda positioner i proteinets sekvens. Dock påverkas dess förmåga av proteinets veckning (3-dimensionella struktur) där endast de exponerade positionerna blir tillgängliga. Vi har studerat ett stort antal olika proteasers förmåga att klippa i amyloidformen av transthyretin. Genom detta kan vi tillsammans med tidigare data bygga modeller av hur fibrillen är uppbyggd. Ett oväntat och intressant fynd är att vissa proteaser klipper sönder fibrillen utan att den förlorar sin struktur medan andra leder till att amyloidstrukturen omedelbart kollapsar. Detta innebär att vi har en möjlighet att identifiera nyckelpositioner inom struktur och sekvens som är absolut nödvändiga för att hålla samman fibrillen.  

Studier av transthyretin från fisk (Spaurus Aurata) samt bakterie Eschericha coli
Transthyretin är ett evolutionärt konserverat protein där sekvensen till stora delar är bevarad. Sekvensen mellan människa och fisk skiljer sig med 48% (Spaurus Aurata). Vi har undersökt om transthyretin från fisk trots sekvensskillanden har förmåga att bilda fibriller. Våra resultat är entydiga och pekar på att transthyretin från fisk kan bilda fibrer vilket intressant nog innebär att 52% av transthyretins aminosyror faktiskt är utbytbara något som har en inverkan på hur resultat från olika mutationsanalyser skall tolkas. För att vidare undersöka denna tes så har vi även analyserat ett så kallat transthyretin besläktat protein från e.coli. Sekvenshomologin är i det här fallet mycket låg. Vi kan dock även här inducera bildning av amyloidfibriller vilket sammantaget ger en ny och intressant vinkel på frågeställningen om det är sekvens eller struktur som avgör bildningen av transthyretin amyloid.

Forskningsrapport 2006

Per Westermark och Anna Ybo

Fortsatta undersökningar av familjär amyloidos av transthyretinnatur
Sammanfattning

Vi arbetar med frågor om hur amyloidfibrillerna uppkommer och hur de inlagras i olika organ. Vi arbetar också med att förbättra metoder att diagnostisera amyloidos.

Transthyretin (TTR) är ett starkt amyloidbildande protein som är huvudkomponenten i amyloid vid en åldersberoende amyloidosform (senil systemamyloidos) och i ett antal familjära amyloidosformer. Olika mutationer i arvsmassan leder till de ärftliga formerna men vid den åldersbetingade sjukdomen är det normalt protein som inlagras. Den mest spridda formen av ärftlig amyloidos, i Sverige ofta kallad Skellefteå sjukan, eller ”familjär amyloidotisk polyneuropati” (FAP), kännetecknas av nervsymptom men inlagringar av amyloid finns i många vävnader och hjärtsjukdom utgör ett karakteristiskt och allvarligt inslag.

Vi visade för många år sedan att TTR ofta till stor del är kluvet och då endast en del finns inlagrad. Vi fann att detta alltid gällde vid den åldersbetingade formen men varierar vid svensk FAP där ungefär hälften av individerna hade huvudsakligen helt TTR och den andra hälften kluvna molekyler i amyloidfibrillerna. Vilken roll klyvningen av TTR kan spela i amyloidutvecklingen är ännu helt okänt. Vår hypotes är att kluvet och icke mutant protein är sådant som kan lagras på inlagringar efter levertransplantation. 

Denna ansökan omfattar en rad frågeställningar.

Tillsammans med professor Ole Suhr försöker vi utreda om ett enkelt prov från bukens underhudsfett kan räcka för att avgöra hur amyloidinlagringarna i andra organ, fr.a. hjärtat är uppbyggda. Vi analyserar prover från såväl fettvävnad som från hjärtat med en rad olika metoder.

Levertransplantation har kommit att bli standardbehandling för svensk FAP. Den neurologiska skadan kan stoppas och eventuellt förbättras men en hos del individer fortsätter hjärtinlagringarna, och detta är givetvis ett allvarligt problem. Det finns f.n. ingen kunskap om varför endast en del individer drabbas. Tillsammans med professor Ole Suhr, Umeå, försöker vi begripa vad som skiljer amyloidinlagringarna och finna på metoder att förutsäga risken för fortsatt hjärtamyloidos. I förlängningen hoppas vi att kunna påverka bildandet av amyloid.

I ett tredje delprojekt undersöker vi om kluvet TTR kan finnas i blodcirkulationen och utgöra en riskfaktor för vidare inlagringar. Här använder vi oss av en ny antikropp, som vi framställt i laboratoriet. Vi har också framställt en antikropp, som bara reagerar med TTR från amyloid och vi har nyligen visat vad det är som gör detta protein unikt. Vi vill nu undersöka om denna form av transthyretin kan påvisas i blodet och användas som diagnostiskt test. Också detta arbete sker tillsammans med professor Ole Suhr.  

Arbete med att förbättra diagnostiken

Ett av våra kliniska huvudintressen över åren har varit att utveckla och förfina diagnostiska metoder för systemisk amyloidos. Vi tog för många år sedan fram den nu allmänt använda bukfettsbiopsimetoden och har sedan utvecklat denna till att användas för typbestämning av amyloid. I vårt arbete ingår att få fram specifika antikroppar att användas i denna diagnostik. Vi bedriver också en upplysningsverksamhet då ett av de stora problemen inom diagnostiken är bristande kunskap hos behandlande läkare och patologer i områden i Sverige där familjär amyloidos är mer ovanligt.  

Det arbete som FAMY, FAMY Norrbotten och Stiftelsen Amyl utför har varit och är av mycket stor betydelse för forskningsverksamheten. Anslagen har inneburit att vi kunnat knyta nya forskare till oss vilket både lett till nya resultat och till att fler forskare har fått upp ögonen för de så viktiga men ofta ganska okända amyloidossjukdomarna. Här finns en viktig symbios mellan forskare och företrädare för patientföreningarna.

Forskningsrapport 2006

Erik Lundgren årsrapport  

Amyloidbildning av transthyretin - metod för utveckling av hämmande läkemedel. 

I tidigare redovisning har vi angivit varför vi valt bananfluga (Drosophila melanogaster) för våra studier. Syftet med projektet är att förstå hur transthyretin (TTR) bildar toxiska aggregat och amyloidfibriller och hur dessa åstadkommer skada på perifera nerver. Vidare att hitta läkemedel som antingen hämmar bildning av aggregat, löser upp dem eller hämmar deras toxiska effekter. 

Vanligtvis brukar man göra försök på däggdjur, innan man kan gå över till försök på människa. Framställning av möss med den humana muterade genen är den adekvata modellen för sådana försök. Tyvärr har det visat sig att möss, till vilka man för in den humana genen dessvärre inte återspeglar den humana sjukdomen. De bildar aggregat, men först sent i musens livscykel och utan att ge symptom. Med andra ord man kan inte pröva läkemedelskandidater, då det inte finns någon effekt att mäta. 

Det är beklagligt, då man känner till flera sådana som fungerar i provrör, men där prövning på försöksdjur inte är meningsfullt, då man inte kan avläsa någon effekt. Vi har därför valt bananfluga inte bara för att hitta ett alternativ, utan även för att det är en experimentorganism, med väl fungerade metoder för genetisk manipulation, och där de etiska reglerna som gäller för högre försöksdjur inte är gällande. 

Som experimentell modell är bananflugan en utmaning. Den humana sjukdomen debuterar i Portugal i medeltal i 25-årsåldern och i Sverige i 55-årsåldern. Bananflugan har en livslängd på några veckor. Vi har nu fått fram stammar av bananfluga med mutationer av TTR, som har utvecklat tydliga neurologiska symptom, när det gäller att klättra och flyga. Mest slående är en defekt i vingarnas hållning, som ses redan efter 2 dagar. En tolkning är att bananflugan saknar ett skyddssystem, som människa har och som leder till att man får aggregat och symtom först efter årtionden. Bananflugan tillåter experiment för att påvisa en sådan faktor, som har intresse bland annat för att förklara varför inte alla med mutationen utvecklar sjukdomen, eller varför den debuterar sent i livet. 

Nyligen kunde forskare i Portugal och USA påvisa i samarbete att det fanns andra gener som är kopplade till sjukdomsuppkomst (Soares ML, Coelho T, Sousa A et al. Susceptibility and modifier genes in Portuguese transthyretin V30M amyloid polyneuropathy: complexity in a single-gene disease. Hum Mol Genet 2005;14(4):543-53. ) En sådan är SAP, som bestämmer strukturen för ett protein som binder till alla former av amyloid, och som enligt våra studier dessutom hindrar toxisk effekt. En genvariant av detta protein gör att man får tidig start av sjukdomen. Ett annat sådan protein är det vitamin A bindande proteinet RBP. 

Jag ber att få lämna följande redovisning, som är sammanfattad i ett arbete som genomgår revision inför publicering. 

1. Vi har karaktäriserat tre genetiskt modifierade flugstammar med mutationer av TTR.

2. Enbart stammar med muterat TTR får aggregat och neurologisk påverkan, under det att icke muterat protein inte ger symptom.

3. Mängden protein och typ av mutation avgör om man får aggregat och symptom. Vi arbetar vidare för att förstå vilka villkor som skall vara uppfyllda för att få detta vid ytterligare mutanter såsom TTRV30M, mutationen vid den svenska formen av Familjär amyloidos med polyneuropati (’Skellefteåsjukan’).

4. De viktigaste symtomen är svårigheter att klättra, att flyga och nedhängande vingar. Dessutom förkortas livslängden.

5. I pågående försök kan vi visa att ett av de preparat (diflunisal), som stabiliserar TTR också hindrar uppkomst av symtom. Det betyder att vi har visat att principen fungerar.

6. Vi har framställt ett antal stammar med SAP-genen, som kommer att korsas med stammar med muterat TTR, för att se vilket roll den kan ha för att bestämma sjukdomsförlopp.

Register avseende forskningsrapporter år 2005

Erik Lundgren - Amyloidbildning av transthyretin -metod för utveckling av hämmande läkemedel
Ole Suhr - Kommentarer till olika arbeten
Elisabeth Sauer-Eriksson - Strukturella studier av transthyretin
Urban Viklund, Rolf Hörnsten, samt Steen Jensen, Ole Suhr - Hjärtfrekvensvariabilitet hos patienter med familjär amyloidos med polyneuropati - tippbräda eller Holter?
Per Westermark - Två typer av amyloidinlagringar

Forskningsrapport 2005

Per Westermark

Två typer av amyloidinlagringar

Forskningsarbetet, stött av FAMY, FAMY Norrbotten och Stiftelsen AMYL, har följt forskningsplanen. Vi har startat ett samarbete med professor Ole Suhr, Umeå rörande de två typer av amyloidinlagring, som vi kunnat visa förekommer i hjärtat vid svensk FAP. Typerna förekommer inte tillsammans. Den ena formen av inlagring, som uppbyggs av helt transthyretin, är ofta intracellulär i cardiomyocyter och har ett specifikt elektronmikroskopiskt utseende. Den andra inlagringstypen är alltid extracellulär, bildar större sammanhängande amyloidinlagringar och består till stor del av C-terminala transthyretindelar. Tillsammans med professor Suhr försöker vi nu korrelera de två olika typerna till klinisk bild. Det är möjligt att formen med helt transthyretin debuterar vid tidigare är än den med kluvet transthyretin. Arbetet pågår.

Det kluvna transthyretin, som förekommer i den ena formen av amyloidos, består huvudsakligen av fragment som startar i position 46, 49 och 52. Vi har under året satt upp en metod att uttrycka och renat ett fragment som börjar i position 50 (transthyretin50-127). Vi har nu tillräcklig mängd av detta fragment för att starta studier av detta proteins egenskaper. Vi har i preliminära experiment visat att fragmentet bildar amyloidlika fibriller. Vi kan nu testa under vilka förhållande fibriller bildas och hur de skiljer sig från sådana som bildats av helt transthyretin. Vi kan nu också studera effekten av aggregerat protein på celler i kultur.

Vi har under året lagt ned mycket arbete på att förbättra diagnosmetoderna vid transthyretinamyloidos. Vi har funnit att det fortfarande finns en oacceptabelt hög 1felprocent i denna diagnostik. Vi arbetar både med att förbättra påvisande av amyloid och med att utveckla en exakt metod att bestämma typen av amyloid. För det senare utvecklar vi specifika antikroppar.

 Arbeten publicerade eller nytillkomna under året 

1.        P Westermark, GT Westermark: Purification of transthyretin and transthyretin fragments from amyloid-rich human tissues
           Meth Mol Biol 299, 255-260, 2005 

2.         J Bergström, Å Gustavsson, U Hellman, K Sletten, CL Murphy, DT Weiss, A Solomon, B-O Olofsson,  P Westermark: Amyloid deposits in transthyretin-derived amyloidosis: Cleaved transthyretin is associated with distinct amyloid morphology
J Path, 206, 224-232, 2005 

3.        G Holmgren, U Hellman, J Jonasson, H-E Lundgren, P Westermark, OB Suhr: A
            Swedish family with the rare Phe33Leu transthyretin mutation
             Amyloid, 12, 189-192, 2005 

4.        P Westermark: Aspects on human amyloid forms and their fibril polypeptides
           FEBS J 272, 5942-5949, 2005 

5.        NHH Heegaard, MZ Hansen, JW Sen, M Christiansen, P Westermark:
           Comparison of immunoaffinity liquid chromatography an immunoprecipitation combined with mass spectrometry for
           aracterization of transthyretin in blood from normal and amyloidotic individuals
           J Separation Science, in press 2006

Forskningsrapport 2005
 

Urban Wiklund, Rolf Hörnsten     
Övriga medarbetare: Steen Jensen, Ole B. Suhr

Hjärtfrekvensvariabilitet hos patienter med familjär amyloidos med polyneuropati – tippbräda eller Holter?

 Sammanfattning 

Vi har studerat hur hjärtfrekvensen varierar från hjärtslag till hjärtslag hos 56 patienter med familjär amyloidos med polyneuropati (FAP), samt jämfört med 90 friska försökspersoner. Data har analyserats från två olika undersökningar, dels vid en undersökning i liggande samt efter tippning till upprätt position, dels vid mätning under ett dygn i med s.k. Holter-registrering. 

I denna studie har vi för första gången analyserat hjärtfrekvensvariabilitet från 24-timmars registreringar av EKG. Tjugo patienter uteslöts från bedömning av den autonoma funktionen p.g.a. frekventa extraslag och/eller för dåliga registreringar. Nio av dessa patienter hade intermittent förmaksarytmi, vilket först upptäcktes som ett bredbandigt mönster vid analysen av hjärtfrekvensvariabilitet, samt efter re-analys av Holter. De återstående 36 patienter visade på reducerad hjärtfrekvensvariabilitet inom samtliga spektrala mått jämfört med de friska försökspersonerna. 

Vi har funnit att reducerad hjärtfrekvensvariabilitet från 24-timmars Holter är ett vanligt fynd hos patienter med FAP, vilket överensstämmer med fynd från korttidsanalyser. Studien har även visat att studier av den autonoma regleringen av hjärtfrekvensen försvåras av att förmaksarytmi är mycket vanligt hos patienter med FAP. Sannolikt återspeglar detta inlagringar av amyloid i hjärtats förmak. 

Studien har resulterat i ett abstrakt presenterat vid 6th International symposium on familial amyloidotic polyneuropathy and other transthyretin related disorders & the 5th international workshop on liver transplantation in familial amyloidotic polyneuropathy, 24-26 augusti 2005, La Jolla, California, USA. Ett manuskript är under utarbetning för inskickning till en vetenskaplig tidskrift under våren 2006. 

Hjärtfrekvensvariabilitet hos patienter med familjär amyloidos med polyneuropati – tippbräda eller Holter? 

 Introduktion

 Målsättningen med vårt projekt var att 

1.   Analysera data från s.k. korttids-HRV analys i liggande och efter passiv tippning till upprätt position, samt jämföra med friska försökspersoner.

2.   Analysera data från s.k. långtids-HRV analys uppmätt vid Holter-registreringar, samt jämföra med friska försökspersoner.

3.    Att undersöka om det finns något samband mellan metoderna kortttids-HRV och långtids-HRV hos FAP-patienter.  

Avsikten var att undersöka om metoderna var för sig, eller om kombinationen av dessa två undersökningsmetoder, ger säkrare bedömningar av autonoma funktionsrubbningar eller andra rubbningar i hjärtrytm hos patienter med FAP. 

Under året har vi främst arbetat med delprojekt 2, d.v.s. analys av hjärtfrekvensvariabilitet från 24-timmarsregistreringar. Vi håller på med ett manuskript som snart är klart för inskickning.  Data för jämförelse med korttidsregistreringar är inmatat, men ingen sammanställning av jämförelsen mellan de två undersökningsmetoderna har hunnit tas fram. 

I denna rapport redovisas även hittills utfört arbete inom de andra delprojekten. 

Hjärtfrekvensvariabilitet (HRV, heart rate variability)

Den signal som uttrycker hjärtfrekvensen (beräknad ur RR-intervallen i ett EKG) är beroende av ett flertal fysiologiska rytmers samtidiga inflytande på sinusknutans impulsbildning, där det autonoma nervsystemet har en viktig roll för finjusteringen av tidpunkten för varje nytt hjärtslag. I början av 1980-talet introducerades spektralanalys som en metod för att analysera slag-till-slag variationen i hjärtfrekvens. Med denna metod bearbetas matematiskt tidsavsnitten mellan de enskilda hjärtslagens signaler i EKG till ett frekvensspektrum. Detta innehåller ett kvantitativt mått på totala variabiliteten (vilket motsvarar signalens varians) i det analyserade EKG-avsnittet, men visar också i vilken utsträckning denna variabilitet är beroende av modulering via de sympatiska respektive parasympatiska delarna av nervsystemet.

Analysen av variabiliteten inom det s.k. lågfrekvensområdet (LF) från 0.04-0.15 Hz har associerats med den baroreflex-medierade regleringen av blodtrycket, vilken återspeglar både sympatisk och parasympatisk aktivitet i den autonoma styrningen av det kardiovaskulära systemet. Förändringar av den lågfrekventa variabiliteten i HRV efter förändringar av kroppsläget, t.ex. efter passiv tippning till upprätt kroppsläge, har i vissa studier föreslagits kunna användas som en markör av förändringar i sympatisk aktivitet. De högfrekventa (HF) svängningarna inom frekvensområdet 0.15-0.50 Hz återspeglar hos de flesta friska individer andningsynkrona förändringar i hjärtfrekvens, och används ofta som ett index på parasympatisk aktivitet. 

Specifikt för detta projekt är att vi även fokuserat på HRV inom frekvensområdet 0.50-1.00 Hz (Very high frequency, VHF). Förekomsten av HRV inom detta frekvensområde har tidigare associerats med parasympatísk dysfunktion hos hjärttransplanterade. Vi har tidigare funnit att flera FAP-patienter har liknande HRV-fynd i korttidsregisteringar, men associerat detta med misstanke om förmaksarytmi.

 Material och metoder

 Femtiosex patienter med DNA- och biopsiverifierad förekomst av FAP har undersökts i samband med utredning inför en eventuell levertransplantation. Patienterna har undersökts med avseende på hjärtfrekvensvariabilitet både baserat på korttidregistreringar samt utifrån Holterregistreringar som tidigare använts för arytmianalys. 

Som kontrollgrupp har tidigare publicerade referensvärden från 120 friska försökspersoner använts, vilka undersökts med samma metodik och utrustning.

 Hjärtfrekvensvariabilitet

Samtliga patienter och försökspersoner har undersökts med långtids-HRV från 24-timmars Holter med analys av dygnsmedelvärden och timsmedelvärden i frekvensdomän och dygnsmedelvärden i tidsdomän. Dessutom har vi analyserat data från korttids HRV-undersökningar i laboratoriemässig miljö, vilket inkluderar mätning i liggande position samt efter tippning till upprätt position.

Holter-registrering

Vi har även utvärderat 24-timmars EKG(Holter) med avseende på överlednings- och rytmrubbningar hos samtliga patienter.

 Resultat

 Långtids-HRV:

Tjugo patienter exkluderades från spektralanalys av HRV från pga frekventa estraslag och/ eller störningar. Nio av dessa hade intermittent förmaksarytmi, vilket först upptäcktes efter HRV-analys (bredbandigt mönster) samt re-analys av Holter.

 De återstående 36 patienterna hade reducerad HRV med avseende på samtliga spektrala mått jämfört med kontrollerna (p<0.001) och då främst inom LF-området.

 Långtids-HRV vs övriga kardiovaskulära variabler:

Inget signifikant samband sågs mellan övriga undersökningar (sena potentialer, ekokardiografiska mått, arytmiförekomst) och långtids-HRV.

Långtids-HRV vs korttids-HRV

Vi har påbörjat analyserna av eventuella samband mellan de två olika HRV-metoderna. Data är dock ej färdiganalyserat. 

 Diskussion 

Vi har funnit att reducerad hjärtfrekvensvariabilitet från 24-timmars Holter är ett vanligt fynd hos patienter med FAP, vilket överensstämmer med tidigare fynd från korttidsanalyser. Studien har visat att studier av den autonoma regleringen av hjärtfrekvensen försvåras av att förmaksarytmi är mycket vanligt hos patienter med FAP. Sannolikt återspeglar detta inlagringar av amyloid i hjärtats förmak. Vi har även funnit att bredbandiga mönster i HRV-spektrum kan vara ett tidigt tecken på förmaksarytmi. Denna del av studien är i princip avslutad och utarbetning av ett manus pågår.  

Vi har för avsikt att fortsätta att arbeta med jämförelsen mellan långtids-HRV och korttids-HRV för ännu bättre kunna bedöma förekomsten och graden av autonoma funktionsrubbningar hos FAP-patienter, vilket används kliniskt för att bedöma risken för blodtrycksfall i samband med levertransplantation.

 I tidigare studier hos patienter med ischemisk hjärtsjukdom har man sett att positiva fynd av sena potentialer och reducerad HRV är prediktorer för ventrikulära takykarytmier. Hos patienter med FAP har vi inte funnit något sådant samband.

Forskningsrapport 2005

Elisabeth Sauer-Eriksson
 

STRUKTURELLA STUDIER AV TRANSTHYRETIN

Bakgrund

För att till fullo kunna förstå ett proteins funktion så måste vi ha information om hur proteinet ser ut, dvs vi måste veta dess struktur. Med protein kristallografi kan vi studera ett proteins struktur till en så hög upplösning att enskilda atomer kan urskiljas. Om vi vet ett proteins struktur kan vi få en mycket bättre föreställning om vilken eller vilka typer av molekyler som kan binda in till proteinet och därmed förändra eller förhindra funktionen hos proteinet. Därför är tillgången av en struktur ett stort hjälpmedel för utvecklingen av nya mediciner.

Den lösliga formen av transthyretin kan med lätthet studeras med protein kristallografi. Problem uppstår dock med den olösliga formen av transthyretin där protein molekylerna har kletat ihop sig och bildat den fiber struktur som kallas för amyloid och som ger upphov till sjukdom (FAP). Vårt projekt går ut på att försöka strukturellt karakterisera både den lösliga och den olösliga formen av proteinet. Den lösliga formen studerar vi bland annat i komplex med olika molekyler som binder till den aktiva ytan (tyroxin-bindings ytan) av proteinet. Här pekar forskning på att en möjlighet att förhindra uppkomst av amyloid fibrer kan vara att förstärka strukturen av den lösliga formen av proteinet med hjälp av olika stabiliserande molekyler. Detaljerad information om hur dessa molekyler exakt binder in till proteinet är därför av stort intresse eftersom det ökar våra möjligheter att på olika sätt kunna förändra de stabiliserande molekylerna så att de bättre kan binda in till proteinet. När det gäller att studera strukturen av transthyretin i själva amyloiden är problematiken svårare. För att kringgå problemen arbetar vi med att försöka hitta betingelser under vilka vi kan fånga viktiga strukturförändringen inom proteinet innan proteinet börjar bilda fibrer.  Mycket av vårt arbete gör vi i nära samarbete med Prof. Erik Lundgren på molekylärbiologiska institutionen vid Umeå universitet.

Uppnådda resultat 2005

Under året har vi bland annat publicerat ett delprojekt där vi karakteriserat inbindning av fria jodid joner till transthyretin (1). De bundna jodid jonerna verkar stabilisera transthyretinets struktur och till en viss del hämma transthyretinets förmåga till amyloidbildning. Jodid är huvudkomponent i bildandet av thyroxin och tillförs kroppen från t.ex. dricksvatten och koksalt (jodberikat). Det bör dock påpekas att vi måste tillsätta jodid jonerna i stora mängder i provröret för att få en amyloidhämmande effekt. Vi har även avslutat en strukturstudie där vi visat att en del av transthyretins struktur – den så kallade D-strängen – har en betydligt högre

Vi har även avslutat ett arbete på att karakterisera den mycket amyloidogena mutanten Tyr114Cys (2). Denna mutant har vi jämfört med Val30Met och sett att den uppför sig annorlunda. Speciellt intressant är att vi lyckats rena fram en disulfid-linkad dimer form av proteinet som kan bilda amyloid. Detta är mycket intressant då tidigare arbete utfört av andra visar att det är en monomer-form av proteinet som ger upphov till amyloidbildning. Vi arbetar nu på att strukturellt karakterisera denna dimer form.

Avslutningsvis vill jag tacka FAMY, FAMY-Norrbotten och Stiftelsen Amyl för tidigare tilldelning av anslag. Det har varit till en mycket stor hjälp för våra möjligheter att genomföra våra projekt.

Forskningsrapport 2005 

Ole Suhr

Kommentarer till olika arbeten
(lista över publikationer till olika arbeten finns på FAMY-Norrbottens kansli) 

Arbete 1 är en gemensam polsk-svensk case report om en ovanlig komplikation till transthyretin-amyloidos, observerad i Polen, nämligen leverruptur. Denna komplikation har rapporterats från andra amyloidossjukdomar, såsom den sällsynta Lysozyme amyloidos från England och vid den så kallade AL-amyloidos (amyloidos framkallad av blodsjukdom), men inte vid transthyretinamyloidos. 

Arbeten 2 och 6 är rapporter om mutationer som inte tidigare har diagnosticerats i Sverige, av vilka en är helt ny. För alla dessa nya mutationer gäller att hjärtkomplikationer är en framträdande del av symptombilden. 

Arbete 3 är en gemensam tysk-svensk rapport om hjärttransplantation av en patient med senil systemisk amyloidos, alltså en transthyretinamyloidos där amyloiden består av normalt, icke-muterat transthyretin. Att även icke muterat transthyretin kan bilda amyloid är välkänt, men brukar enbart ses hos patienter över 75 - 80 års ålder, och ger sällan allvarliga symptom. 

Arbeten 4 och 11 rör sig om långtidsuppföljning av levertransplanterade patienter, dels med avseende på njurfunktion (4) och överlevnad (11). Vi påvisar att patienterna drabbas av en betydande njurfunktionsnedsättning i samband med transplantationen, men därefter ses ingen betydande försämring, i motsats till andra levertransplanterade, där njurfunktionen brukar påverkas negativt över tiden, ett glädjande och inte väntat resultat, då många FAP-patienter har en njurpåverkan och vi därför misstänkte att detta kunde leda till en mera uttalad successiv försämring på grund av den avstötningsmedicin som man måste behandla med. 

I arbete 11 påvisar vi en förbättrad överlevnad för transplanterade patienter, men enbart om man har transplanterats innan sjukdomen har gått för långt, speciellt innan man har fått ett dåligt näringstillstånd. 

I arbete 5 har vi i samarbete med Japanska forskare påvisat betydelsen av så kallade advanced glycation end products (AGE) för njurskada vid transthyretinamyloidos. Det är en liknande skada som man ser vid diabetisk njursjukdom, och det kan också förklara de likheter som finns mellan njurskadan vid dessa två annars så olika sjukdomar. 

I arbeten 7, 9 och 10 har vi undersökt hjärtkomplikationer vid FAP. Vi har använt avancerad hjärtechoteknik, såkallad ”strain” undersökning, som ger en bild av hjärtmuskelns funktion och rörlighet. Vi har då påvisat tidiga förändringar hos FAP patienter, innan man kan påvisa några förändringar med normal undersökningsteknik. Vi är intresserade av detta, då vi har hittat fortsatt utveckling av hjärtkomplikationer efter levertransplantation, och denna utveckling kan eventuellt vara  kopplat till förekomst av amyloid i hjärtat innan transplantationen. 

Arbete 10 är en undersökning av patienter med hypertrof cardiomyopati, alltså patienter som har utvecklat en hjärtförstoring av oklar orsak. Många av dessa patienter har en mutation, ändring av arvsanlaget för muskelprotein, men hos många hittar man ingen förklaring. Vi påvisade att 4 patienter hade FAP-mutationen, och inga av dessa patienter hade symptom på nervskada. FAP kan alltså ha enbart hjärtkomplikationer. 

I arbete 10 har vi undersökt FAP patienter med en avancerat EKG-undersökning, ”late potentials” som är kopplat till benägenhet att utveckla hjärtarrhythmier. Vi har haft patienter med extraslag och i något fall har vi använt en speciell pacemaker som kan avbryta dessa arrhythmier. Vi tror att man med denna undersökning ska kunna identifiera patienter som har ökad risk för att få hjärtarrhythmier. 

Arbete 8 är en intressant undersökning av kliniska symptom och överlevnad hos homozygota FAP-patienter. Homozygota patienter har en dubbel uppsättning av den muterade transthyretingenen, de har alltså fått anlaget från båda mamman och pappan. Flera av dessa patienter utvecklade enbart sjukdomen i ögat, fick aldrig nervsymptom eller andra manifestationer av FAP sjukdomen. Dessutom var deras överlevnad inte kortare, utan snarare längre än den man ser hos heterozygota (enbart ett förändrat arvsanlag). Dessutom fick alla homyzygota patienter ögonsjukdom, men ingen hade hjärtsymptom. Detta styrker betydelsen av normalt transthyretin för sjukdomsutveckling, och den eventuella förekomsten av olika processer för amyloidbildning. 

Arbete 11 är ett samarbetsprojekt med japanska forskare. Vi har undersökt transthyretinets benägenhet att bilda amyloid under olika förhållande, bland annat efter tillförsel av Zink till transthyretin. Zink verkar binda sig till transthyretin och minska benägenheten att bilda amyloid, denna verkan förstärktes vid samtidig tillsatts av thyroideahormon, och även diflunisal, ett ämne som tidigare har visat sig kunna minska transthyretins benägenhet att bilda amyloid och det ämne som vi kommer att testa i en klinisk studie. Dessa fynd kan mycket väl ha terapeutiska implikationer.

Forskningsrapport 2005 

Erik Lundgren 
 

Amyloidbildning av transthyretin - metod för utveckling av hämmande läkemedel.  

Detta är en fortsättning av tidigare redovisning av projektet som gäller att framställa en sjukdomsmodell i bananfluga (Drosophila Melanogaster). Som beskrevs vid förra årets rapportering sker prövning av läkemedelskandidater i flera steg. Syftet är att ha en klar uppfattning både om verkningsmekanismer och effekt innan prövning sker på svårt sjuka människor. Lagstiftningen föreskriver därför att man först gör provrörsexperiment och sedan djurförsök. I fallet FAP kompliceras detta av att möss, som man vanligtvis använder, inte utvecklar amyloid när den muterade genen förs in. De brukar ej heller utveckla symptom, som lämpliga läkemedelskandidater kan testas mot.

Vi har därför utvecklat bananfluga som ett modellsystem. Valet av denna organism beror på att människor och bananfluga är mycket lika när det gäller en del grundläggande biologiska egenskaper som hur celler växer och dör eller hur utvecklingen från befruktat ägg till vuxen organism sker. Ett annat sådant hett och mycket grundläggande forskningsområde är hur proteiners form regleras. Amyloidbildning är exempel på en sådan frågeställning där bananfluga är ett bra verktyg. Bananfluga erbjuder dessutom möjlighet till att genetiskt manipulera utan att experimenten kolliderar med de kontroversiella etiska problem som användning av försöksdjur innebär. 

Jag ber att få göra följande uppdatering av fjolårets redovisning.

¨ Vi har för närvarande framställt genetiskt modifierade flugstammar för fem olika mutationer av TTR, inklusive TTR V30M.

¨ Genom att påverka reglermekanismer i dessa stammar kan vi uppnå olika mängder av muterat TTR

¨ Enligt planen har vi lyckats få uttryck av dessa gener i ögat, men även i flera andra organ. Vi har även sett ansamling av TTR i fettkroppens celler.

¨ Icke muterat TTR bildar inte aggregat, i kontrast till alla de mutanter som vi använt, om än i mycket olika grad. Detta bör betraktas som ett slutligt bevis för att mutationer är nödvändiga för att ge amyloid. Det reser frågan om de är tillräckliga. Det är anmärkningsvärt att flugorna får aggregat efter några veckor, under det att det tar minst 30 år innan människa får det. Det antyder att människa har skyddsmekanismer, som flugor saknar.

¨ Vi har kunnat visa att aggregat förstör celler i olika kroppsdelar: vi ser celldöd i hjärnan och i fettkroppen; det senare är en motsvarighet till levern.

¨ Bildning av aggregat och tecken på celldöd är kopplat till beteendeförändringar. Dessa djur kan inte klättra eller flyga. Deras vingar är förändrade och deras  livslängd är förkortad.

¨ I fettkroppens celler ser vi stora aggregat, i regel i celler som har tydliga tecken på celldöd. Aggregaten innehåller tätt packade partiklar, som ter sig rundade. Liknande har beskrivits för andra amyloidformer, och anses kunna ge upphov till porer i cellmembranet.

¨ I preliminära pågående studier har vi kunnat visa att muterat TTR bildar porer i konstgjorda cellmembran, som tillåter inflöde av calciumjoner. Detta sker i samarbete med prof. Roland Benz, Wurzburg.

¨ Vi utvärderar för närvarande de olika sjukdomssymptom som flugorna har utvecklat för att se vilka av dessa vi kan använda för att testa olika substanser som kan tjäna som läkemedelskandidater. Vi använder Diflunisal som positiv kontroll, som vi vet från provrörsförsök hämmar amyloidbildning. Ett tjugotal substanser prövas för närvarande i i samarbete med Anders Olofsson, UCMP och Fredrik Almqvist, Org. Kemi på cellkulturer för att testa koncentrationer lämpliga att blanda i flugmaten. Vi har även fått tillgång till ett 10-tal substanser från prof. Jeff Kelly, La Jolla, USA, som vi skall prövas under våren.
Alla dessa data håller för närvarande på att sammanställas för vetenskapliga uppsatser. 

Medlen från patientorganisationerna har varit till mycket stor nytta för vår forskning. Som tidigare rapporterats har vi fått medel för bananflugeprojektet av Djurskyddsmyndigheten. Detta projekt ingår även i en stor ansökan till EU, koordinerat av Per Westermark, Uppsala, besked kommer till sommaren. Än en gång vill jag uttrycka min tacksamhet till patientföreningarna för deras uthålliga stöd till vår forskning. 

Register avseende forskningsrapporter år 2004

Elisabeth Sauer Eriksson - Strukturella studier av transthyretin

Erik Lundgren - Amyloidbildning av transthyretin - metod för utveckling av hämmande läkemedel. 

Ole Suhr - Klinisk och experimentell amyloidosforskning vid Medicinkliniken, Norrlands Universitetssjukhus

Intissar Anan - Olika behandlingsalternativ för FAP

Per Westermark & Joakim Bergström - Snabb och säker diagnostik av amyloid vid Familjär Amyloidos med Polyneuropati (FAP)

Rolf Hörnsten och Urban Wiklund - Analys av "små vågor" i EKG och hjärtrytm hos patienter med familjär amyloidos med polyneuropati

Forskningsrapport 2004 

Elisabeth Sauer-Eriksson

STRUKTURELLA STUDIER AV TRANSTHYRETIN

Bakgrund

För att till fullo kunna förstå ett proteins funktion så måste vi ha information om hur proteinet ser ut, dvs vi måste veta dess struktur. Med protein kristallografi kan vi studera ett proteins struktur till en så hög upplösning att enskilda atomer kan urskiljas. Om vi vet ett proteins struktur kan vi få en mycket bättre föreställning om vilken eller vilka typer av molekyler som kan binda in till proteinet och därmed förändra eller förhindra funktionen hos proteinet. Därför är tillgången av en struktur ett stort hjälpmedel för utvecklingen av nya mediciner.

Den lösliga formen av transthyretin kan med lätthet studeras med protein kristallografi. Problem uppstår dock med den olösliga formen av transthyretin där protein molekylerna har kletat ihop sig och bildat den fiber struktur som kallas för amyloid och som ger upphov till sjukdom (FAP). Vårt projekt går ut på att försöka strukturellt karakterisera både den lösliga och den olösliga formen av proteinet. Den lösliga formen studerar vi bland annat i komplex med olika molekyler som binder till den aktiva ytan (tyroxin-bindings ytan) av proteinet. Här pekar forskning på att en möjlighet att förhindra uppkomst av amyloid fibrer kan vara att förstärka strukturen av den lösliga formen av proteinet med hjälp av olika stabiliserande molekyler. Detaljerad information om hur dessa molekyler exakt binder in till proteinet är därför av stort intresse eftersom det ökar våra möjligheter att på olika sätt kunna förändra de stabiliserande molekylerna så att de bättre kan binda in till proteinet. När det gäller att studera strukturen av transthyretin i själva amyloiden är problematiken svårare. För att kringgå problemen arbetar vi med att försöka hitta betingelser under vilka vi kan fånga viktiga strukturförändringen inom proteinet innan proteinet börjar bilda fibrer.  Mycket av vårt arbete gör vi i nära samarbete med Prof. Erik Lundgren på molekylärbiologiska institutionen vid Umeå universitet.

Uppnådda resultat 2004

Under året har vi bland annat avslutat ett delprojekt där vi karakteriserat inbindning av fria jodid joner till transthyretin (1). De bundna jodid jonerna verkar stabilisera transthyretinets struktur och till en viss del hämma transthyretinets förmåga till amyloidbildning. Jodid är huvudkomponent i bildandet av thyroxin och tillförs kroppen från t.ex. dricksvatten och koksalt (jodberikat). Det bör dock påpekas att vi måste tillsätta jodid jonerna i stora mängder i provröret för att få en amyloidhämmande effekt. Vi har även avslutat en strukturstudie där vi visat att en del av transthyretins struktur – den så kallade D-strängen – har en betydligt högre flexibilitet i den normala strukturen av transthyretin än vad tidigare studier påvisat. Denna flexibilitet har man tidigare endast kopplat samman med en grupp av mycket amyloidbenägna mutanter av TTR. Vi kan nu visa att en sådan koppling inte finns utan att denna flexibilitet även existerar hos TTR mutanter som är mindre benägna att bilda amyloid (2). Dessa två arbeten ingick i min doktorand Andreas Hörnbergs avhandling som han försvarade i februari 2004. Vi har även fortsatt med våra strukturella studier på TTR från andra arter och karakterisering av TTR från fisk (3). Strukturen av fisk TTR är väldigt lik strukturen av mänskligt TTR. Våra preliminära data visade att fisk TTR inte kan bilda amyloid. Nu har vi visat att under vissa betingelser kan fisk TTR också bilda amyloid. Vad vi hoppas finna med dessa typer av studier är en förklaring till vad det är i strukturen hos just mänskligt TTR som gör att just människan kan insjukna i FAP.

Vi håller också på att avsluta ett arbete på att karakterisera den mycket amyloidogena mutanten Tyr114Cys (4).  Denna mutant har vi jämfört med Val30Met och sett att den uppför sig annorlunda. Speciellt intressant är att vi lyckats rena fram en disulfid-linkad dimer form av proteinet som kan bilda amyloid. Detta är mycket intressant då tidigare arbete utfört av andra visar att det är en monomer-form av proteinet som ger upphov till amyloidbildning. Vi arbetar nu på att strukturellt karakterisera denna dimer form.

Avslutningsvis vill jag tacka FAMY, FAMY-Norrbotten och Stiftelsen Amyl för tidigare tilldelning av anslag. Det har varit till en mycket stor hjälp för våra möjligheter att genomföra våra projekt.

Forskningsrapport 2004 

Erik Lundgren

Amyloidbildning av transthyretin - metod för utveckling av hämmande läkemedel. 

Detta är en fortsättning av tidigare redovisning av projektet som gäller att framställa en sjukdomsmodell i bananfluga (Drosophila Melanogaster). I korthet är bakgrunden följande. Prövning av läkemedelskandidater måste ske i flera steg. En molekylär mekanisms skall demonstreras i provrörsexperiment, sedan görs djurförsök, innan man enligt gällande praxis och lagstiftning får pröva på människa. Som tidigare redovisats har detta visat sig omöjligt på möss, de utvecklar amyloid mycket sent, i små mängder, och med en organfördelning som inte är adekvat. De utvecklar ej heller symptom, som är lämpade för att testa läkemedelskandidater.                      

Vi har därför utvecklat bananfluga som ett modellsystem. Det kan förefall underligt, men det har visat sig att i många avseenden har vi gener som är lika bananflugans. Det gäller särskilt grundläggande biologiska fenomen. Ett sådant är formförändringar hos proteiner, som sker i alla livsformer. Och till sådana grundläggande formförändringar hör amyloidbildning. Bananfluga erbjuder dessutom möjlighet till att genetiskt manipulera utan de etiska problem som är förknippade med test på högre djurarter eller sjuka människor. 

I fjolårets redovisning angav vi att ett antal mål uppnåtts, som nu har utvidgats.

1)        Vi har lyckats göra stabila, genetiskt identifierade flugstammar för bland annat 4 muterade TTR-gener, inklusive TTRV30M.

2)        Vi har framgångsrikt fått uttryck av muterat TTR i flugans nervsystem.

3)        Vi har definitivt visat att TTR-mutanter bildar aggregat, som skadar nervsystemet.

4)        Underligt nog gäller det inte TTRV30M med ett aminosyreskifte, däremot mutanter som har två eller tre aminosyreskiften. Det kan ha att göra med den tid som Skellefteåmutationen behöver för att utveckla sjukdomen (drygt 50år, att jämföra med flugornas livslängd på ett par månader). En annan möjlighet är att flugorna har en försvarsmekanism. Flugorna lämpar sig väl för att söka efter genetisk information, som kan tänkas hindra aggregering. Det kan vara utgångspunkt för sökande efter mekanismer att hämma toxisk aggregatbildning. Vi planerar längre fram sådana studier.

5)        Vi vet sedan tidigare att bananflugor med muterat TTR har en defekt röresleförmåga. Det gäller förmågan att klättra och att flyga. Sådana egenskaper har stor betydelse, när vi skall testa intessanta substanser, som kan hämma aggregatbildning. Man behöver nämligen ett objektivt test för att visa att substanser fungerar. Men det är en sak att se att de klättrar dåligt eller inte flyger, en annan att testa detta objektivt med kvantitativa metoder. Vi har använt tilldelade medel för att utveckla instrument för dessa test. Ett av dessa bygger på att vid flykt blockerar flugorna ett laserstråle. Detta har visat sig vara en framgångsrik metod och kommer att utvecklas ytterligare. 

6)        Vi har intlett studier i samarbete med Anders Olofsson, UCMP och Fredrik Almqvist, Org. Kemi för att testa ett batteri av substanser, som i andra system har hämmat aggregering av proteiner.

       En sammanställning pågår för närvarande av dessa data till en eller två uppsatser. 

       Det har varit frustrerande att flugprojektet tar lång tid. Vi behöver hela tiden kläcka flugägg, korsa flugor och invänta förpuppning. Det är ett omfattande och tidskrävande arbete. Det har likaså varit mödosamt att utveckla objektiva test. Vi ser nu att vi lyckats utveckla robusta och användbara metoder och har därför inlett försök med att blanda in intressanta substanser i flugmaten.

       Medlen från patientorgansiationerna har varit till mycket stor nytta för den instrumentutveckling vi har gjort under året. Till vår glädje har bananflugeprojektet prioriterats högt av Djurskyddsmyndigheten, så att medel för två år (700,000 kr/år) har beviljats. Detta är så mycket mer glädjande som det stöd vi fått från Wallenbergsstiftelsen för flugprojektet går ut med slutet av detta år. Det innebär att vi säkrat en fortsättning på detta spännande projekt när vi nått en punkt där vi kan testa substanser, som är läkemedelskandidater. Får jag därför än en gång uttrycka min tacksamhet för beviljade medel och för den uppmuntran det innebär för oss att få del av pateintföreningarnas uthålliga stöd för vår forskning.

Forskarrapport år 2004 

Ole Suhr

Klinisk och experimentell amyloidosforskning vid Medicinkliniken, Norrlands Universitetssjukhus

(Lista över publikationer till olika arbeten finns på FAMY-Norrbottens kansli) 

 Kliniska symptom av sjukdomen samt aspekter vid transplantation

I arbete 2 rapporterar vi om graviditet efter levertransplantation för FAP. Det rör sig om 5 graviditeter, varav 3 var barn med levertransplanterad pappa och 2 var lyckade graviditeter hos levertransplanterade mödrar. Alla graviditeter och förlossningar var utan komplikationer, och barnen var välskapta med normal födelsesvikt. 

I artikel 3 redovisar vi långtidsresultaten av levertransplantation för FAP med avseende på utvecklingen av hjärtrytmrubbningar efter levertransplantation. Det visar sig, att ca 50 % efter ca 8 års uppföljning har hjärtrytmrubbning som kräver pacemakerbehandling. Vi har tidigare redovisat utveckling av ökad hjärtstorlek efter transplantation, och vi tror att det finns ett samband mellan utveckling av ökad hjärtstorlek och rytmrubbning. Vi har därför föreslagit att alla FAP-patienter efter transplantation bör genomgå årlig undersökning med långtids EKG-undersökning. 

I arbete 5 har vi undersökt alla patienter som har genomgått undersökning med arbets-EKG för att se om man får uppgifter av betydelse för bedömning av patienten inför levertransplantation. Undersökningen visar att kranskärlsjukdom är ovanligt hos FAP-patienter. Att de som hade abnormt EKG antingen hade en sedan tidigare känd kranskärlssjukdom eller också hade de normala kranskärl vid kranskärlsröntgen, alltså hade man ingen större glädje av arbets-EKG inför transplantation.  

Artikel 8 är ett gemensamt arbete med tyska transplantationskirurger. Vi undersökte biopsimaterial och blodprover från en 60-årig patient med hjärtamyloidos. Genetisk testning visade ingen mutation av transthyretingenen, men den amyloid som fanns i biopsier var av transthyretintyp. Det rörde sig alltså om en senil systemisk amyloidos, en amyloidostyp som vanligt ses i avancerad ålder, men som hade drabbat denna drygt 60-åriga patient. Han genomgick därför enbart hjärttransplantation med lyckad resultat. Vi tror att det finns ett samband mellan senil systemisk amyloidos och de hjärkomplikationer som vi har hittat hos transplanterade FAP-patienter, och vi arbetar vidare på detta spår. 

Artikel 9 är en långtidsuppföljning av njurfunktionen hos transplanterade FAP-patienter. Då nedsatt njurfunktion är vanligt förekommande hos FAP-patienter, har vi länge misstänkt, att detta kunde bli ett stort problem, då immunsupprimerande behandling också kan skada njurfunktionen. Emellertid har vi inte hittat någon succesiv försämring av njurfunktionen  efter transplantation, vilket är en klar skillnad jämfört med andra transplanterade patienter. Vi tror att man dels hejdar amyloidbildningen i  njuren med transplantation men även minskad produktion av ”advanced glycation end products” (se kommentar till arbete 10), och sålunda får en förbättring av njurfunktionen som uppväger påverkan av immunsupprimering, vilket är en god nyhet. 

Artikel 11. Detta är en kommentar till en artikel om genterapi som behandling av FAP. Vad man uppnår med den speciella typ av genterapi som publicerades var en minskning av muteret transthyretin med ca 10%, vilket skall jämföras med över 95% vid transplantation, alltså en beskedlig minskning vid genterapi, som sannolikt inte i kommer att ha inverkan på amylodbildning. Emellertid fanns det lovande aspekter vid behandlingen, som kan utvecklas vidare. 

Mekanismer för amyloidbildning och behandlingsmöjligheter. ( arbeten 1 och 10)

I arbete 1 har vi tillsammans med tyska forskare tittat på amyloidbildning och betydelsen av svavelförbindelser och deras oxidering, alltså syrepåverkan. Vi  har sedan tidigare påvisat olika grader av oxidering av transthyretin hos friska anlagsbärare och hos patienter med sjukdomen. Därför har vi bl.a. provat ”scavengerbehandling”, behandling med ämnen som tar hand om aktiva syremolekyler i vävnader, som dock inte verkade ha någon effekt. Det har emellertid sedan kommit flera arbeten, där man speciellt är intresserad i olika svavelhaltiga äggviteämnen och deras benägenhet att kopplas till transthyretin, vilket skulle ge möjlighet för fibrillbildning. Vi visar i ovanstående arbete att man får en påverkan av transthyretinmolekylens stabilitet beroende på oxidationsgrad av svavelförbindelser. Detta skulle kunna ha terapeutiska implikationer. 

I artikel 10 undersöker vi ”advanced glycation end products” (AGE), och visar att dessa toxiska substanser finns i njurar från patienter med FAP, och att de sannolikt spelar en betydande roll för njurskada vid FAP-sjukdomen. Vi har senare fortsatt på samma spår, och det finns klara belägg för att samma substanser återfinns i amyloidinlagringar vid flera transthyretinmutationer, men även vid andra typer av amyloidos såsom Gelsolin-amyloidos (ärftlig finsk nerv-amyloidos). AGE är misstänkt att spela en betydande roll för komplikationer till diabetes, och det finns substanser under förutveckling som skulle kunna skydda mot AGE påverkan. 

Genetiska aspekter och nya mutationer.  (Arbeten 4, 6 och 7)

I arbete 4 har vi undersökt genetisk material från svenska, japanska (från Kumamoto) och portugisisk/ spanska FAP-patienter med speciell analys för att se om alla FAP-mutationer kommer från samma individ, alltså om sjukdomen har spritt sig från en person i Portugal genom följande generationer så småningom till Sverige och Japan, eller om det rör sig om spontana mutationer i varje land: Har svenska FAP-patienter en gemensam svensk förfader som muterade sitt transthyretin? Denna undersökning visade att japanska och portugisisk/spanska patienter sannolikt har samma ursprung i Portugal, medan svenska patienter har en svensk ”grundare”. Detta är ett lite överraskande resultat. 

I artikel 6 presenterar vi en uppföljning av våra enäggstvillingpar, där fortfarande en tvilling har sjukdomen medan den andra var frisk i båda tvillingparen. Uppföljningstiden är nu 13 år för första tvillingparet och fortfarande är den ene frisk medan den andra har avlidit i sjukdomen. För andra tvillingparet är det på samma sätt men uppföljningen är enbart några år. Fynden pekar på betydelsen av miljöfaktorer för att sjukdomen skall bryta ut. 

I arbete 7 beskriver vi två nyupptäckta mutationer i Sverige. I båda fallen finns ingen nervskada, men däremot hjärtsymtom i form av hjärtsvikt - hjärtförstoring. Den ena patienten dog relativt hastigt i svår hjärtsvikt, medan den andra mutationen inte verkar ge en lika aggressiv amyloidossjukdom. Den ene mutation var inte beskriven från något annat land medan den andra fanns i Frankrike, dock med andra symtom (symtom från hjärnan). 

1.        Vi påvisar att njurfunktionsnedsättningen är vanlig men svårdiagnosticerad hos FAP-patienter.

2.        En för Sverige ny mutation, Phe33Leu transthyretin, som hittades mitt i Norrbottens FAP-populationen.

3.        Undersökning av hjärtrytmrubbningar med specialanalys av EKG. Det finns ofta störningar av hjärtats elektriska signaler i hjärtmuskeln som kan vara ett tidigt tecken till rytmrubbning.

4.        Första gången vi kan påvisa ökad överlevnad hos transplanterade jämfört med icke-transplanterade patienter.

5.        Undersökning av betydelsen av dubbel uppsättning av mutationen för FAP (alltså ärvt genen från båda mamma och pappa). Vi ser ingen mera aggressiv sjukdom hos dessa patienter, däremot har alla ögonkomplikationer, jämfört med enbart ca 10% hos dom som enbart har ett anlag. Skillnader i amyloidbildning i ögat med dess speciella miljö jämfört med kroppen i övrigt?
Intressant fynd, då de flesta försök med amyloidbildning görs med rent muteret transthyretin; det kan finnas skillnader mellan dessa resultat och det som händer med patienten.

6.        Här påvisar vi tidiga störningar i hjärtats rörlighet hos FAP-patienter, skillnader som kommer innan man ser förtjockning av hjärtmusklen.

7.         Vi har hittat patienter med FAP med enbart hjärtsymptom i form av hjärtsvikt och rytmrubbningar. Liknar ganska mycket bilden som vi ser vid senil transthyretinamyloidos, men dessa patienter är yngre. Helt nya upptäckter, FAP kan alltså ha enbart hjärtkomplikationer.

Forskningsrapport år 2004 

Intissar Anan

Olika behandlingsalternativ för FAP

1. Nedsatt njurfunktion är en vanlig komplikation hos FAP. Studier har visat att Advanced glycation end products (AGE) tros spela en viktig roll i uppkomsten och patogenes i FAP. Vi har studerat förekomsten av AGE och RAGE (receptor for AGE) i njurar hos FAP. Resultaten visade att njurarna hos FAP hade mycket inlagringar av amyloid, AGE och RAGE, dessutom hade transplanterade patienter lägre halt av AGE i serum jämfört med icke transplanterade patienter. Vidare hade FAP patienter högre AGE koncentration i serum jämfört med frisk kontroll grupp. Slutsatsen är att ackumulering av amyloid, AGE och RAGE spelar en viktig roll i njurdysfunktion hos FAP.

2. Transgen-mus projektet fortgår. I början använde vi en albumin promotor (framjare) och enhancer (förstärkare). De första förberedelserna på cell-linjer visade att hela konstruktet fungerar och att transthyretin  (prealbumin) proteinet gav uttryck på cell-linjenivå. Vid framställning av transgena möss, fick vi ett antal transgener men ingen av dem gav något uttryck för proteinet. Nu är projektet inriktat på att byta ut hela promotor/enhancer regionen mot ett nytt. Det nya konstruktet innehåller prealbumin promotor och enhancer. Denna kombination har testats tidigare i ett annat system och fungerar alldeles utmärkt och verkar ge uttryck för proteinet in vivo, dvs att det uttrycke i levande varelser såsom mus. Vi har klipp konstruktet och fått in vår transthyretin gen inklippt i konstruktet. Vi kommer att få undersöka att vi ha fått in rätt gen och att allt är ok, därefter kommer det att testas på cell-linjer innan det är dags att ta fram en transgen mus. 

Publikationer accepterade under 2004 och till dagens datum. 

1. Noriko Matsunaga¹, Intissar Anan¹, Peter Rosenberg¹, Ryoji Nagai², Ola Lundström³, Seikoh Horiuchi², Yukio Ando⁴ and Ole B Suhr¹. Adavanced glycation end product is implicated in amyloid-related kidney complications. 

2. Gösta Holmgren,¹ Urban Hellman,¹ Intissar Anan,² Hans-Eric Lundgren,² Jonason J¹, Stafberg C³ Sämi Fahoum⁴ and Ole B Suhr². Cases of late onset cardiac amyloidosis with the new  (Gly53Glu) and His88Arg transthyretin variants in Swedish patients. 

Dessutom finns följande arbeten i manuskript:

3. Ole B Suhr, Intissar Anan, Kim Ekbom, Gösta Holmgren, Anders Rydh, Maria Svensson. Kidney Function in Familial Amyloidosis with Polyneuropathy (FAP), Portuguese Type. Skickad för publikation.

Forskningsrapport år 2004

Per Westermark & Joakim Bergström 

Snabb och säker diagnostik av amyloid vid Familjär Amyloidos med Polyneuropati (FAP)

 Under det gångna året har Joakim Bergström disputerat på en avhandling med titeln ”Apolipoprotein A-IV and transthyretin in Swedish forms of systemic amyloidosis”. Avhandlingen bygger på fyra delarbeten där arbetena I och II (1) karakteriserar den samtidiga förekomsten av två olika systemiska amyloidosformer hos en och samma individ men där amyloidinlagringarna är separata. Fynden är principiellt viktiga eftersom de visar att en typ av amyloid inte nödvändigtvis påverkar uppkomsten av amyloidfibriller från ett annat protein. I arbete III (2) visar vi att amyloidinlagringarna vid FAP är av två olika typer. En form innehåller helt transthyretin medan den andra har amyloidinlagringar bestående av transthyretinfragment. Utseendet hos dessa två skiljer sig liksom fördelningen av amyloidinlagringarna i vävnaderna. Formen med kluvet transthyretin liknar mycket den åldersberoende senila systemamyloidosen, vilken är en vanlig amyloidform hos äldre och som är mer godartad. Stämmer detta vid FAP kan det tänkas att det där finns två grupper av patienter där den ena har en litet mer gynnsam prognos. Vi undersöker möjligheterna att studera dessa två former vidare. I arbete IV har betydelsen av H-strängen vid amyloidbildning undersökts. Till skillnad från vad som beskrivits från konstgjorda transthyretinfibriller har vi funnit att i amyloidinlagringar är H-strängen åtminstone delvis exponerad på fibrillytan. Detta arbete fortsätter.
Arbetet har fortsatt med att förbättra diagnostikmetoden vid systemisk amyloidos för att dels tidigt avgöra förekomst av amyloid hos en individ med symtom och dels bestämma formen av amyloidinlagring. Vår utvecklade metod som bygger på en biopsi från bukfettvävnad fungerar bra. Vi arbetar vidare med att försöka utveckla en metod som tillåter mindre mängd vävnad. Vi arbetar också med att försöka förenkla typningsmetoden.

Arbeten publicerade eller nytillkomna under året

1. Bergström J, Murphy CL, Weiss DT, Solomon A, Sletten K, Hellman U, Westermark P: Two different types of amyloid deposits – apolipoprotein A-IV and transthyretin – in a patient with systemic amyloidosis

Lab Invest 84: 981-988, 2004

2. Bergström J, Gustavsson Å, Hellman U, Sletten K, Murphy CL, Weiss DT, Solomon A, Olofsson B-O, Westermark P: Amyloid deposits in transthyretin derived amyloidosis: Cleaved transthyretin is associated with distinct amyloid morphology

J Path, in press 2005

3. Bergström J, Engström U, Westermark P: Structure of in vivo formed transthyretin amyloid fibril

Manuscript

4. Bergström J: Apolipoprotein A-IV and transthyretin in Swedish forms of systemic amyloidosis. Akademisk avhandling, Uppsala 2004
5. Westermark P, Davey E, Lindbom K, Enqvist S: Subcutaneous fat tissue for diagnosis and studies of systemic amyloidosis

Acta Histochem, in press 2005

Forskningsrapport år 2004 

Rolf Hörnsten och Urban Wiklund  

Analys av "små vågor" i EKG och hjärtrytm hos patienter med familjär amyloidos med polyneuropati

Vår forskning handlar främst om olika analyser av EKG-registreringar från patienter med familjär amyloidos med polyneuropati (FAP).  Vår målsättning att undersöka om de relativt sett små förändringar som vi tidigare funnit i EKG hos patienter med FAP kan indikera en ökad risk för att utveckla mer uttalade hjärtrytmrubbningar.  

Vi har analyserat data från EKG-registreringar från femtiofem patienter med DNA- och biopsiverifierad FAP, vilka har undersökts i samband med utredning inför en eventuell levertransplantation, och jämfört med registreringar från ca 94 friska försökspersoner.  

Huvudfyndet hittills är att s.k. sena potentialer i EKG hade dubbelt så hög förekomst hos FAP-patienter (38 %), än hos de friska försökspersonerna (19%). Sena potentialer återfanns framför allt hos de FAP-patienter som även uppvisade tecken på hjärtrytmrubbningar på kammarnivå vid registrering av 24-timmars EKG (Holter-EKG). Förekomst av sena potentialer i EKG kan därför innebära en ökad risk för arytmi hos patienter med FAP. Vi har sammanställt denna del av studien i en vetenskaplig rapport som inskickad för granskning och bedömning. 

Vi håller för närvarande på och analyserar om det finns något samband mellan förändringar i hjärtfrekvensvariabilitet (dvs. hur ”pulsen” varierar från hjärtslag till hjärtslag) och arytmifynd i Holter-EKG registreringar samt förekomsten av sena potentialer. Den statistiska analysen av detta data pågår och vi har för avsikt att publicerad våra fynd under året. 

Register avseende forskningsrapporter för år 2003

Henryk Wilczek - Register avseende levertransplantation och dominolevertrans-plantation hos FAP-patienter

Per Westermark & Joakim Bergström - Studier av patogenes och utveckling av diagnostik vid FAP

Erik Lundgren - Amyloidbildning av transtyretin - metod för utveckling av hämmande läkemedel

Elisabeth Sauer-Eriksson - Strukturella studier av transtyretin, årsrapport 2003

Elisabeth Sauer-Eriksson - Strukturella studier av transtyretin, årsrapport 2002

Ole Suhr - Klinisk och experimentell amyloidosforskning.

Intissar Annan - Förbättras patienternas ventrikelretention efter levertransplantation? 

Urban Wiklund & Rolf Hörnsten m.fl. -  Riskbedömning av hjärtrytmrubbningar hos patienter med FAP baserat på analys av sena potentialer i EKG.

Forskningsrapport år 2003 

Henryk Wilczek

Register avseende levertransplantation och domino-levertransplantation hos FAP-patienter.

I världsregistret avseende levertransplantation hos patienter med Familiär Amyloidos med Polyneuropati (Familial Amyloidotic Polyneuropathy World Transplant Register, FAPWTR) fanns 694 patienter registrerade den 31 december 2002. Sedan den första levertransplantationen för denna diagnos utfördes i Stockholm 1990, har behandlingsmetoden spridits över världen och registret omfattar nu patienter från 57 olika centra i 16 länder. Ett nytt center i USA har tillkommit sedan årsrapporten 2001.  

Världsregistret avseende s.k. domino-levertransplantation (Domino Liver Transplant Register, DLTR) har vuxit och innehåller nu data på 230 domino-levertransplantationer utförda hos 228 patienter vid 27 centra i 12 länder. Begreppet dominolever-transplantation betyder att en uttagen FAP-lever i sin tur återanvänds och transplanteras till en annan svårt, icke-FAP leversjuk patient. Tekniken med domino-transplantation börjar bli vida spridd och det förekommer idag ett utbyte av domino-levrar mellan sjukhus, både nationellt och internationellt.  

Resultat:

Endast 61 transplantationer rapporterades för år 2002, medan antalet för år 2001 har ökat från 67 i 2001 års rapport till 73 i årets rapport. Denna skenbara diskrepans beror på en fördröjning hos de olika sjukhusen när det gäller rapporteringen till FAPWTR. Medelåldern hos FAP-patienterna vid tidpunkten för transplantation är 40,7 år och sjukdomsdurationen är i medeltal 4,7 år. Siffrorna ligger relativt konstant jämfört med tidigare år. 

Trettiosex av FAP-patienterna erhöll sin lever från en levande donator. Antalet kombinerade transplantationer som rapporterats till FAPWTR är fortfarande relativt lågt och omfattar 20 kombinerade lever- och njurtransplantationer, 9 kombinerade lever- och hjärttransplantationer samt en patient som genomgått en kombinerad lever-, njur- och hjärttransplantation. 

TTR-mutationen Val30Met är fortfarande den ojämförligt vanligaste mutationen och förekommer hos mer än 80 % av FAP-patienterna, men andra mutationer har dock klart ökat med tiden. Utöver Val30Met, har mer än 25 olika mindre vanligt förekommande mutationer rapporterats till FAPWTR men antalet patienter inom varje enskild mutation är lågt.

Patientöverlevnaden vid 1 och 5 år efter transplantationen är hos patienter med non-Val30Met mutation 78% respektive 59%, jämfört med 88% och 82 % hos patienter med Val30Met mutation. 

Dominoregistret innehåller inte bara data om levrar från FAP-patienter, utan registrerar även data om levrar som använts för transplantation från patienter med andra metabola sjukdomar såsom t ex oxalos. Dock utgör levrar från FAP-patienter merparten av de dominolevrar som rapporteras till DLTR. Fram till 31/12 2002, har totalt 230 domino-levertransplantationer rapporterats. Mottagarna är vanligen män (77%) och medelåldern vid transplantationen är 53,9 år. Totalt är den vanligaste indikationen hos majoriteten av dominolever-mottagarna fortfarande tumörsjukdom (54%). Under de senaste åren har det dock skett en tydlig ändring till att acceptera dominolever-recipienter på allt vidare indikationer, och sålunda har andelen patienter med tumörsjukdom under år 2002 sjunkit till 44 %.

Alltsedan den första dominolevertransplantationen utfördes i oktober 1995, har 45 % av levrarnas från FAP-patienter använts för dominolever-transplantation vilket visar att med tiden har denna teknik blivit mer och mer accepterad. Användandet av dominolevrar har med tiden stadigt ökat, och under åren 2000 – 2002 användes c:a 2/3 av FAP-levrarna till dominolever-transplantation. 

En av de främsta dödsorsakerna hos både FAP-patienter och dominomottagare är sepsis, vilket i varje register rapporteras utgöra ca 26% av dödsfallen. I FAPWTR utgör hjärtrelaterad död den vanligaste dödsorsaken (ca 32% av dödsfallen). Bland mottagarna av dominolevrar är tumörrecidiv den vanligaste dödsorsaken (29%). 

Delas dödsfallen in i tidiga (<6 månader efter transplantationen) och sena dödsfall (>6 månader efter transplantationen), så bibehålls fördelningen av dödsorsaker i FAP-gruppen ( ca 26% sepsis och ca 30% hjärtrelaterad död), medan man i dominogruppen ser en viss omfördelning av dödsorsakerna. I gruppen tidiga dödsfall bland dominolever-mottagarna svarar sepsis för ca 45% av dödsfallen, och i gruppen sena dödsfall utgör tumörrecidiv större delen (58%) av dödsfallen. Knappt hälften (47%) av dödsfallen i FAP-gruppen ägde rum inom 6 månader efter transplantationen och i dominolever-gruppen var siffran något högre (52%).

Forskningsrapport för år 2003

Per Westermark och Joakim Bergström

Studier av patogenes och utveckling av diagnostik vid Familjär Amyloidos med Polyneuropati (FAP) 

Amyloidinlagringar består av aggregerade äggviteämnen, som antagit en abnorm veckning, ledande till bildandet av tunna, i vanligt mikroskop osynliga trådar, fibriller. Fibrillernas och deras förstadiers struktur ligger i all väsentlighet bakom amyloidsubstansens egenskaper att skada celler, att vara svårpåverkbara för kroppens normala försvarsmekanismer och egenskaper som gör att vi kan påvisa amyloid i vävnader. Vi vet idag att många olika proteiner (minst 22 olika är kända) har egenskapen att bilda amyloidinlagringar. Många av dessa uppkommer i enskilda organ i samband med åldrande men en stor grupp ger upphov till de s.k. systemiska amyloidoserna, där inlagringar sker i många av kroppens organ. Framför allt systemiska amyloidoser är allvarliga och direkt livshotande sjukdomar. 

Det enda sättet att säkerställa diagnosen amyloidos är genom ett vävnadsprov, som sedan undersöks mikroskopiskt. Vi utvecklade för relativt länge sedan den s.k. bukfettsbiopsimetoden, som bygger på att vid alla former av systemisk amyloidos inlagringar finns i underhudens fettvävnad. Då all amyloid, oavsett dess biokemiska uppbyggnad vad gäller typ av protein, har likartat utseende och samma färgningsegenskaper, kan man inte med vanlig mikroskopi säkert avgöra vilken form av amyloidinlagring som föreligger. Tidigare spelade detta inte så stor roll eftersom behandlingsalternativen för amyloidos var mycket begränsade. Idag är situationen annorlunda. Specifika behandlingsmetoder har utvecklats för flera former av systemisk amyloidos på så sätt att det är av yttersta vikt att med säkerhet veta vilken form en enskild individ lider av. Systemisk AL-amyloidos, där plasmaceller i benmärgen producerar ett amyloidbildande protein, kan behandlas med cytostatika (cellgifter) och ibland benmärgstransplantation medan familjär transthyretinamyloidos idag bäst behandlas med levertransplantation med goda resultat. Dessa omfattande behandlingsalternativ kräver ofta tidig och framför allt korrekt diagnos, både av amyloid och av amyloidtyp. Här finns idag ganska stora brister. 

Vi har under det senaste året, med hjälp av stöd från FAMY, FAMY-Norrbotten och stiftelsen AMYL, fortsatt vårt arbete med att förbättra amyloidosdiagnostiken, också innefattande typbestämning av påvisade amyloidinlagringar. Vi har funnit att en kirurgisk biopsi från underhudsfettvävnad över bukregionen oftare ger en säkrare amyloidosdiagnos vid systemisk amyloidos än nålbiopsi, inte minst vid transthyretinamyloidos där inlagringarna ibland tenderar att vara påfallande lokala. När amyloidos visats föreligga, ger sådana biopsier också tillräckligt material för typbestämning av amyloid. Vi har tidigare utvecklat en typbestämningsmetod baserad på egenframställda antikroppar mot de i Sverige vanligen förekommande systemiska amyloidosformerna (protein AA, AL-kappa, AL-lambda, transthyretin och apolipoprotein A-I). Denna metod, som baserats på ELISA, fungerar bra vid relativt stora mängder amyloid men har inte tillräcklig känslighet vid små inlagringar eller då biopsimaterialet är ringa. Vi går därför vidare och arbetar på en känsligare analysmetod. 

Sedan jan 2003 har vi omhändertagit 45 prover från patienter med misstänkt eller säkerställd amyloidos. I dessa kunde vi visat inlagringar av systemisk amyloidos i 28 fall. Vi har nu arbetat med en elektroforetisk (western blot) metod att typbestämma amyloidinlagringarna. Vid denna analys löses amyloid och de ingående proteinerna separeras elektroforetiskt och överförs därefter till ett membran. Proteiner kan sedan identifieras med hjälp av specifika antikroppar, riktade mot amyloidfibrillproteiner. För det ändamålet har antikroppar framställts genom att immunisera kanin med syntetiska proteindelar (peptider) motsvarande amyloidfibrillprotein eller med protein renat ur amyloidinlagringar. Våra erfarenheter med metoden är goda och vi kan nu typbestämma de flesta fall av amyloidos. Metoden behöver emellertid göras ännu känsligare och nya antikroppar måste framställas. 

Vi har tidigare rapporterat ett fynd av ett annat protein, apolipoprotein A-IV (apoA-IV), i samband med transthyretinamyloidos. Vi misstänkte att apoA-IV kunde vara en tidigare okänd vanlig komponent i amyloiden. Vidare analyser visade emellertid att apoA-IV kan förekomma som en egen men sällsynt amyloidosform och att apoA-IV inte generellt finns i transthyretinamyloid. 

Sedan jan 2003 har vi omhändertagit 45 prover från patienter med misstänkt eller säkerställd amyloidos. I dessa kunde vi visat inlagringar av systemisk amyloidos i 28 fall. Vi har nu arbetat med en elektroforetisk (western blot) metod att typbestämma amyloidinlagringarna. Vid denna analys löses amyloid och de ingående proteinerna separeras elektroforetiskt och överförs därefter till ett membran. Proteiner kan sedan identifieras med hjälp av specifika antikroppar, riktade mot amyloidfibrillproteiner. För det ändamålet har antikroppar framställts genom att immunisera kanin med syntetiska proteindelar (peptider) motsvarande amyloidfibrillprotein eller med protein renat ur amyloidinlagringar. Våra erfarenheter med metoden är goda och vi kan nu typbestämma de flesta fall av amyloidos. Metoden behöver emellertid göras ännu känsligare och nya antikroppar måste framställas.  

Vi har tidigare rapporterat ett fynd av ett annat protein, apolipoprotein A-IV (apoA-IV), i samband med transthyretinamyloidos. Vi misstänkte att apoA-IV kunde vara en tidigare okänd vanlig komponent i amyloiden. Vidare analyser visade emellertid att apoA-IV kan förekomma som en egen men sällsynt amyloidosform och att apoA-IV inte generellt finns i transthyretinamyloid

Forskningsrapport för  år 2003

Erik Lundgren

Får jag igen uttrycka min tacksamhet över erhållna medel. De är en stor hjälp i vår forskning och det känns uppmuntrande att få stöd för vårt vetenskapliga arbete av den grupp människor som är drabbade av denna tragiska sjukdom.

Elisabeth Sauer-Eriksson

Struktuella studier av transtyretin

För att till fullo kunna förstå ett proteins funktion så måste vi ha information om hur proteinet ser ut, dvs vi måste veta dess struktur. Med protein kristallografi kan vi studera ett proteins struktur till en så hög upplösning att enskilda atomer kan urskiljas. Om vi vet ett proteins struktur kan vi få en mycket bättre föreställning om vilken eller vilka typer av molekyler som kan binda in till proteinet och därmed förändra eller förhindra funktionen hos proteinet. Därför är tillgången av en struktur ett stort hjälpmedel för utvecklingen av nya mediciner.

Forskningsrapport för år 2002

Elisabeth Sauer-Eriksson

Strukturella  studier av transtyretin

För att till fullo kunna förstå ett proteins funktion så måste vi ha information om hur proteinet ser ut, dvs. vi måste veta dess struktur. Med protein kristallografi kan vi studera ett proteins struktur till en så hög upplösning att enskilda atomer kan urskiljas. Om vi vet ett proteins struktur kan vi få en mycket bättre föreställning om vilken eller vilka typer av molekyler som kan binda in till proteinet och därmed förändra eller förhindra funktionen hos proteinet. Därför är tillgången av en struktur ett stort hjälpmedel för utvecklingen av nya mediciner.

Den lösliga formen av transthyretin kan med lätthet studeras med protein kristallografi. Problem uppstår dock med den olösliga formen av transthyretin där protein molekylerna har kletat ihop sig och bildat den fiber struktur som kallas för amyloid och som ger upphov till sjukdom (FAP). Vårt projekt går ut på att försöka strukturellt karakterisera både den lösliga och den olösliga formen av proteinet. Den lösliga formen studerar vi bland annat i komplex med olika molekyler som binder till den aktiva ytan (tyroxin-bindnings ytan) av proteinet. Här pekar forskning på att en möjlighet att förhindra uppkomst av amyloid fibrer kan vara att förstärka strukturen av den lösliga formen av proteinet med hjälp av olika stabiliserande molekyler. Detaljerad information om hur dessa molekyler exakt binder in till proteinet är därför av stort intresse eftersom det ökar våra möjligheter att på olika sätt kunna förändra de stabiliserande molekylerna så att de bättre kan binda in till proteinet. När det gäller att studera strukturen av transthyretin i själva amyloiden är problematiken svårare. För att kringgå problemen arbetar vi med att försöka hitta betingelser under vilka vi kan fånga viktiga strukturförändringen inom proteinet innan proteinet börjar bilda fibrer.  Mycket av vårt arbete gör vi i nära samarbete med Prof. Erik Lundgren på molekylärbiologiska institutionen vid Umeå universitet.

Under året har vi bland annat avslutat ett delprojekt där vi karakteriserat en mutant av TTR som identifierats i en Japansk familj (1). Vi har funnit att denna mutant inte verkar bilda samma typ av amyloid som karakteriserar de övriga mutanterna. Vi arbetar nu vidare med att avsluta den karakteriseringen som vi hoppas skall bidra till att öka förståelsen om TTRs möjligheter att bilda amyloid. Vi har även under året arbetat på ett annat i mitt tycke väldigt spännande projekt. Vi har med hjälp av protein kristallografi tidigare fått fram resultat som visar att den lösliga formen av transthyretin kan binda till fria jodid joner. De bundna jodid jonerna verkar stabilisera transtyretinets struktur och till en viss del hämma transtyretinets förmåga till amyloidbildning. Jodid är huvudkomponent i bildandet av thyroxin och tillförs kroppen från t.ex. dricksvatten och koksalt (jodberikat). Det bör dock påpekas att vi måste tillsätta jodid jonerna i stora mängder i provröret för att få en amyloidhämmande effekt. Huvudprojektet under 2003 kommer att vara att den fortsatta karakteriseringen av jodid joners effekt på transthyretin och vi räknar med att få det arbetet klart vid årsskiftet 2004. Vi utför även strukturella studier på TTR från andra arter och är så gott som klara med en karakterisering av TTR från fisk. Strukturen av fisk TTR är väldigt lik strukturen av mänskligt TTR, ändå har vi visat att fisk TTR inte verkar bilda amyloid.  Vad vi hoppas finna med dessa typer av studier är en förklaring till vad det är i strukturen hos just mänskligt TTR som gör att just människan kan insjukna i FAP medan fisken verkar klara sig.

Avslutningsvis vill jag tacka FAMY, FAMY-Norrbotten och Stiftelsen Amyl för tidigare tilldelning av anslag. Det har varit till en mycket stor hjälp för våra möjligheter att genomföra våra projekt.

Umeå 2003-04-02 

Elisabeth Sauer-Eriksson

Forskningsrapport för år 2003

Ole Suhr

Klinisk och experimentell amyloidosforskning

¨              Sammanfattning av våra transplantationsresultat speciellt med avseende på vävnadsskada och komplikationer.

¨              Sammanfattning av samarbete med danska forskare om i norden förekommande mutationer, härunder också resultaten från Danmark av kombinerade
lever-hjärttransplantation.

¨              Undersökning av magsäckstömningen före och efter transplantation. Vi hittar tecken till förbättring för patienter som transplanteras tidigt, medan dom som transplanteras sent inte uppvisar någon förbättring.

¨              Samarbetsprojekt med tyska forskare med avseende på transthyretin och dess bindning till olika molekyler, härunder speciellt svavelföreningar. Kan ha behandlingsmässiga konsekvenser.

¨              Första rapport om lyckade graviditeter efter transplantation för FAP.

¨              Mycket viktigt arbete om hjärtarytmier (hjärtrytmrubbningar) efter levertransplantation. Det är nu visat att hjärtkomplikationer kan tillstöta efter transplantationen. Detta arbete är en logisk uppföljning av vår upptäckt som redovisades i första arbetet enligt ovan.

¨              Vi har undersökt om arbetsprov är en viktig undersökning av FAP-patienter inför transplantation. Så verkar inte vara fallet. Vi hittade förvånansvärt få patienter med ischämisk hjärtsjukdom (kärlkramp). 

Arbeten i manusform

¨              Undersökning av njurfunktionen efter transplantation. Publicering försenad då man har kompletterat med en kontrollgrupp.

¨              Vi har hittat ännu en transtyretinmutation. Den ger en hjärtamyloidos. Detta är nu den 4:e mutation som vi har hittat.

¨              Undersökning av AGE (utfällning av socker + protein) i förhållande till vävnadsskada i njurar. Vi påvisar att njurskadan vid FAP sannolikt har liknande patogenes (bakomliggande process) som den vid diabetes. Publicering försenad då man önskar kontrollmaterial.

¨              Uppföljning av två monozygota tvillingpar (enäggstvillingar). Hos båda paren är den ene tvillingen sjuk medan den andra är frisk, 2 och 12 år efter tvillingbrodern fick sin sjukdom. Viktigt arbete då det understryker vikten av andra faktorer än de genetiska som orsak till att sjukdomen bryter ut.

¨              Här har vi undersökt patienter med cardiomyopati (hjärtförstoring) med avseende på mutationer i transtyretingenet. Vi hittar sammantaget 4 patienter med ”våran” mutation (FAP Met30) som har debuterat med en cardiomyopati, utan någon nervskada. Inga av dessa patienter hade FAP i släkten. Detta är första rapporten om cardiomyopati som första och viktigaste symptom vid FAP.

Forskarrapport för år 2003

Intissar Anan

Förbättras patienternas ventrikelretention efter levertransplantation?

Våra resultat visar förekomst av en hög frekvens av ventrikelretention före och efter levertransplantation, och ingen påtaglig förbättring kunde registreras för hela gruppen. En minskad ventrikleretention (dålig magsäckstömning) noterades för patienter som haft sjukdomen mindre än fyra år. Från våra resultat kan vi dra slutsatsen att ventrikelretention är en vanlig komplikation hos FAP patienter och att ventrikeltömning hos patienter med sjukdomen mer än fyra år förbättras ej efter levertransplantation.  

Transgen-mus projektet fortgår. I början använde vi en albumin promotor och enhancer. De första förberedelserna på cell-linjer visade att hela konstruktet fungerar och att transthyretin  (prealbumin) proteinet gav uttryck på cell-linjenivå. Vid framställning av transgena möss, fick vi ett antal transgener men ingen av dem gav något uttryck för proteinet. Nu är projektet inriktat på att byta ut hela promotor/enhancer regionen mot ett nytt. Det nya konstruktet innehåller prealbumin promotor och enhancer. Denna kombination har testats tidigare i ett annat system och fungerar alldeles utmärkt och verkar ge uttryck för proteinet in vivo, dvs att det uttrycker i levande varelser såsom mus. Vi har klipp konstruktet och fått in vår transthyretin gen inklippt i konstruktet. Vi kommer att få undersöka att vi ha fått in rätt gen och att allt är ok, därefter kommer det att testas på cell-linjer innan det är dags att ta fram en transgen mus.

Forskarrapport för år 2003

Urban Wiklund & Rolf Hörnsten

Övriga medarbetare: Steen Jensen, Ole B. Suhr.

Riskbedömning av hjärtrytmrubbningar hos patienter med familjär amyloidos med polyneuropati baserat på analys av sena potentialer i EKG

I studien har förekomsten av relativt sett små förändringar i EKG hos patienter med familjär amyloidos med polyneuropati (FAP) studerats. Målsättningen var att undersöka om det finns något samband mellan dessa EKG-förändringar och förekomsten av mer uttalade hjärtrytmrubbningar. Femtio patienter med DNA- och biopsiverifierad FAP undersöktes i samband med utredning inför en eventuell levertransplantation, samt har jämförts med registreringar från ca 120 friska försökspersoner. 

Ventrikulära arytmier är potentiellt livshotande, och kan leda till cirkulationskollaps. Vid adekvat behandling kan däremot ett fullgott allmäntillstånd uppnås. Kostnaderna för en levertransplantation är icke obetydliga och en korrekt ”timing” av transplantationstidpunkt med hänsyn till graden av skada på det autonoma nervsystemet förefaller vara mycket viktig. Det är möjligt att även hänsyn till hjärtengagemang skall tas, då ventrikulära arytmier har setts i ökad omfattning hos patienter som genomgått levertransplantation. Oavsett om patienten genomgår levertransplantation eller ej, är det viktigt att patienter med FAP och potentiellt ökad risk för plötslig hjärtdöd erhåller korrekt antiarrytmisk behandling. Detta inte enbart i livräddande syfte, emedan tillfälligt cirkulationstillstånd som hävs kan ge allvarliga neurologiska skador med nedsatt livskvalitet och ökade vårdkostnader som följd.

Sena potentialer i EKG återfanns hos 40 % av patienterna med FAP, jämfört med hos 20 % av de friska försökspersonerna. Denna skillnad var statistiskt signifikant. Sena potentialer återfanns framför allt hos FAP-patienter som även uppvisade tecken på hjärtrytmrubbningar på kammarnivå vid registrering av 24-timmars EKG. De resultat som hittills uppnåtts, indikerar att förekomst av sena potentialer kan innebära en ökad risk för arytmi hos patienter med FAP. Dessa delresultat är inskickade för presentation vid konferensen Cardiostim 2004 som kommer att hållas i Nice, Frankrike i juni.

Till startsida